Abstract Rationale Highly reproducible in vitro generation of human bronchial epithelium from pluripotent stem cells is an unmet key goal for drug screening to treat lung diseases. The possibility of using induced pluripotent stem cells (hiPSC) to model normal and diseased tissue in vitro from a simple blood sample will reshape drug discovery for chronic lung, monogenic and infectious diseases. Methods We devised a simple and reliable method that drives a blood sample reprogrammed into hiPSC subsequently differentiated within 45 days into air-liquid interface bronchial epithelium (iALI), through key developmental stages, definitive-endoderm (DE) and Ventralized-Anterior-Foregut-Endoderm (vAFE) cells. Results Reprogramming blood cells from one healthy and 3 COPD patients, and from skin-derived fibroblasts obtained in one PCD patient, succeeded in 100% of samples using Sendai viruses. Mean cell purity at DE and vAFE stages was greater than 80%, assessed by expression of CXCR4 and NKX2.1, avoiding the need of cell sorting. When transferred to ALI conditions, vAFE cells reliably differentiated within 4 weeks into bronchial epithelium with large zones covered by beating ciliated, basal, goblets, club cells and neuroendocrine cells as found in vivo . Benchmarking all culture conditions including hiPSCs adaptation to single-cell passaging, cell density and differentiation induction timing allowed for consistently producing iALI bronchial epithelium from the five hiPSC lines. Conclusions Reliable reprogramming and differentiation of blood-derived hiPSCs into mature and functional iALI bronchial epithelium is ready for wider use and this will allow better understanding lung disease pathogenesis and accelerating the development of novel gene therapies and drug discovery.

Under neuroinflammatory conditions, astrocytes acquire a reactive phenotype that drives acute inflammatory injury as well as chronic neurodegeneration. We hypothesized that astrocytic DLL4 may interact with its receptor NOTCH1 on neighboring astrocytes to regulate astrogliosis via downstream juxtacrine signaling pathways. Here we investigated the role of astrocytic DLL4 on neurovascular unit homeostasis under neuroinflammatory conditions. We probed for downstream effectors of the DLL4-NOTCH1 axis and targeted these for therapy in two models of CNS inflammatory disease. We first demonstrated that astrocytic DLL4 is upregulated during neuroinflammation, both in mice and humans, driving astrogliosis and subsequent blood brain barrier permeability and inflammatory infiltration. We then showed that the DLL4-mediated NOTCH1 signaling in astrocytes directly drives IL-6 levels, induces STAT3 phosphorylation promoting upregulation of astrocyte reactivity markers, pro-permeability factor secretion and consequent blood brain barrier destabilization. Finally we revealed that blocking DLL4 with antibodies improves experimental autoimmune encephalomyelitis symptoms in mice, identifying a potential novel therapeutic strategy for CNS autoimmune demyelinating disease. As a general conclusion, this study demonstrates that DLL4-NOTCH1 signaling is not only a key pathway in vascular development and angiogenesis, but also in the control of astrogliosis during neuroinflammation.

Genomic integrity of human pluripotent stem cells (hPSCs) is essential for research and clinical applications. However, genetic abnormalities can accumulate during hPSC generation and routine culture and following gene editing. Their occurrence should be routinely monitored, but the current assays to assess hPSC genomic integrity are not fully suitable for suchregular screening. To address this issue, we first carried out a large meta-analysis of all hPSC genetic abnormalities reported in more than 100 publications and identified 738 recurrent genetic abnormalities (i.e., overlapping abnormalities found in at least five distinct scientific publications). We then developed a test based on the droplet digital PCR technology that can potentially detect 94.3% of these hPSC recurrent genetic abnormalities in DNA extracted from culture supernatant samples. This test can be used to routinely screen genomic integrity in hPSCs.

Pericytes are perivascular cells imbedded within the basement membrane of microvascular endothelial cells. Importantly, pericytes are critical for microvascular integrity especially endothelial barrier integrity and immune quiescence and may participate in organ disease notably vascular dementia or heart failure. However, little is known about pericyte homeostasis in adult tissues. Our aim is to investigate the behavior of pericytes after they have been reduced by 50% in the brain and heart of adult mice. To deplete pericytes in mice, we used diphtheria toxin (DTA)-mediated conditional cell ablation. More specifically, we used Pdgfrb-Cre/ERT2; Rosa-DTA mice, in which DTA expression is induced specifically in pericytes by Pdgfrb promoter-driven expression of Cre/ERT2 and may be temporally controlled by tamoxifen injections. To induce a 50% pericyte depletion, adult mice were injected with 1 mg tamoxifen for 2 consecutive days and sacrificed 4, 7, 14, 21 and 28 days after the first injection to follow their fate over time. We found pericytes are renewed both in the brain and in the heart. Their renewal follows the same kinetic in both organs, i.e. their number starts to increase between 7 and 14 days after the first tamoxifen injection and pericytes are fully renewed 21 days after they were depleted. The origin of the new pericytes is still under investigation, however, what we found is that pericytes being renewed, transiently express smooth muscle actin alpha 2 (ACTA2), at least in the heart. This study indicates for the first time that pericytes can undergo extensive remodeling after tissue injury in adults.