ABSTRACT Mycobacterium tuberculosis (Mtb) genetic micro-diversity in clinical isolates may underline mycobacterial adaptive response during the course of tuberculosis (TB) and provide insights to anti-TB treatment response and emergence of resistance. Herein we followed within-host evolution of Mtb clinical isolates in a cohort of patients with delayed Mtb culture conversion. We captured the genetic diversity of both the initial and the last Mtb isolate obtained in each patient, by focusing on minor variants detected as unfixed single nucleotide polymorphisms (SNPs). To unmask antibiotic tolerant sub-populations, we exposed the last Mtb isolate to rifampicin (RIF) prior to whole genome sequencing analysis. We were able to detect unfixed SNPs within the Mtb isolates for 9/12 patients, and non-synonymous (ns) SNPs in 6/12 patients. Furthermore, RIF exposure revealed 8 additional unfixed nsSNP unlinked to drug resistance. To better understand the dynamics of Mtb micro-diversity during the course of TB, we investigated the variant composition of a persistent Mtb clinical isolate before and after controlled stress experiments chosen to mimic the course of TB disease. A minor variant, featuring a particular mycocerosates profile, became enriched during both RIF exposure and macrophage infection. The variant was associated with drug tolerance and intracellular persistence, consistent with the pharmacological modeling predicting increased risk of treatment failure. A thorough study of such variants, not necessarily linked to canonical drug-resistance and which may be able to promote anti-TB drug tolerance, may be crucial to prevent the subsequent emergence of resistance. Taken together, the present findings support the further exploration of Mtb micro-diversity as a promising tool to detect patients at risk of poorly responding to anti-TB treatment, ultimately allowing improved and personalized TB management. Author summary Tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), bacteria that are able to persist inside the patient for many months or years, thus requiring long antibiotic treatments. Here we focused on TB patients with delayed response to treatment and we performed genetic characterization of Mtb isolates to search for sub-populations that may tolerate anti-TB drugs. We found that Mtb cultured from 9/12 patients contained different sub-populations, and in vitro drug exposure revealed 8 other sub-populations, none related to known drug-resistance mechanisms. Furthermore, we characterized a Mtb variant isolated from a sub-population growing in the presence of rifampicin (RIF), a major anti-TB drug. We found that this variant featured a modified lipidic envelope, and that it was able to develop in the presence of RIF and inside human macrophage cells. We performed pharmacological modelling and found that this kind of variant may be related to a poor response to treatment. In conclusion, searching for particular Mtb sub-populations may help to detect patients at risk of treatment failure and provide additional guidance for TB management.

ABSTRACT Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, is still the number one deadly contagious disease. Mtb infection results in a wide spectrum of clinical presentations and severity symptoms, but without proven Mtb genetic determinants. Thanks to a collection of 355 clinical isolates with associated patient’s clinical data, we showed that Mtb micro-diversity within patient isolates is strongly correlated with TB-associated severity scores. Interestingly, this diversity is driven by a selection pressure to adapt to different lifestyles related to the infection site. Taken together, these results provide a new insight to better understand TB pathophysiology. Furthermore, Mtb micro-diversity could be envisioned as a new prognostic tool to improve the management of TB patients.

Public health organizations consider the multidrug resistant and opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii , as a major global health concern. This species hosts multiple variants of AbaR-type genomic islands which carry several antibiotic resistance, including to carbapenems (AbaR4 variant). How these islands, conferring multidrug resistance, persist in A. baumannii populations remains elusive. Using complementary approaches, we investigated whether the manipulation of natural transformation by AbaRs, via their insertion strategy in the bacterial chromosome, might give them a selective advantage and contribute to the persistence of antibiotic resistance genes in A. baumannii populations. Natural transformation is a process through which bacteria can import and recombine exogenous DNA, facilitating gene transfer and allelic recombination. Although transformation promotes acquisition of mobile genetic elements (MGEs), it is also proposed to serve as a mechanism to purge them from the chromosome. Several MGEs inhibit transformation, suggesting that natural transformation can impede their evolutionary dynamics. We established an experimental model in which natural transformation spontaneously occurs in A. baumannii populations, allowing us to determine the rate of acquisition and removal of MGEs. We found that the majority of AbaRs disrupt the comM gene, causing differential inhibition of MGE acquisition, removal and allelic transfer events. A mathematical evolutionary model shows that AbaRs inserting into the comM gene gain a selective advantage over AbaRs whose insertion site either do not inhibit or completely inhibit transformation. The comM insertion strategy is advantageous when the model incorporates some degree of environmental complexity, such as combined antibiotic stress or changes in environmental resources. Our work highlights how AbaRs, and potentially other MGEs, can manipulate natural transformation to persist in populations, resulting in the high prevalence of multidrug resistance.

Horizontal gene transfer (HGT) is known to promote the spread of genes in bacterial communities, which is of primary importance to human health when these genes provide resistance to antibiotics. Among the main HGT mechanisms, natural transformation stands out as being widespread and encoded by the bacterial core genome. From an evolutionary perspective, transformation is often viewed as a mean to generate genetic diversity and mixing within bacterial populations. However, another recent paradigm proposes that its main evolutionary function would be to cure bacterial genomes from their parasitic mobile genetic elements (MGEs). Here, we propose to combine these two seemingly opposing points of view because MGEs, although costly for bacterial cells, can carry functions that are point-in-time beneficial to bacteria under stressful conditions (e.g. antibiotic resistance genes under antibiotic exposure). Using computational modeling, we show that, in stochastic environments (unpredictable stress exposure), an intermediate transformation rate maximizes bacterial fitness by allowing the reversible integration of MGEs carrying resistance genes but costly for the replication of host cells. By ensuring such reversible genetic diversification (acquisition then removal of MGEs), transformation would be a key mechanism for stabilizing the bacterial genome in the long term, which would explain its striking conservation.

ABSTRACT Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infections result in a wide spectrum of clinical presentations but without proven Mtb genetic determinants. Herein, 234 pulmonary tuberculosis (TB) patients were stratified according to TB disease severity and Mtb genetic features were explored using whole genome sequencing, including heterologous single nucleotide polymorphism (SNP) calling to explore micro-diversity. Clinical isolates from patients with mild TB carried mutations in genes associated with host-pathogen interaction, while those from patients with moderate/severe TB carried mutations associated with regulatory mechanisms. Genome-wide association study identified a SNP in the promoter of the gene coding for the virulence regulator EspR associated with moderate/severe disease. Structural equation modelling and model comparisons indicated that TB severity was associated with the detection of Mtb micro-diversity within clinical isolates and to the espR SNP. Taken together, these results provide a new insight to better understand TB pathophysiology and could provide new prognosis tool for pulmonary TB severity.

ABSTRACT Pollen limitation has a considerable influence on forest masting, the highly variable and synchronised seed production, on which forest regeneration and ecosystem dynamics largely rely. Depending on the various mechanisms possibly involved in pollen limitation, the consequences of climate change on masting could be very different. These mechanisms were investigated in 10 oak populations along a climatic gradient using surveys of airborne pollen and fruiting rate as a proxy of pollen limitation. We found no support for the widely accepted hypothesis of the intra‐annual synchrony of flower phenology when considered in isolation. Instead, the fruiting rate was largely explained by a combination of intra‐annual flower phenology synchrony, annual investment in flowering and the effects of weather on pollen maturation and diffusion. These findings highlight the need for a cohesive theoretical framework for pollen limitation to accurately predict the impact of climate change on oak‐dominated ecosystems.