Summary Pre-ribosomal RNA is selectively transcribed by RNA Polymerase (Pol) I in eukaryotes. The yeast transcription factor Upstream Activating Factor (UAF) represses Pol II transcription and mediates Pol I preinitiation complex (PIC) formation during the early stages of transcription initiation at the 35S ribosomal RNA gene. To unravel the DNA recognition and Pol I selection mechanisms of UAF, we determined the structure of UAF bound to native promoter DNA and transcription factor TBP. We found that UAF recognizes DNA using a hexameric histone-like scaffold with markedly different interactions than the nucleosome and the histone-fold-rich TFIID. UAF strategically sequesters TBP from DNA and Pol II/III-specific factors, and positions it for Core Factor binding, supporting Pol I recruitment. Our findings therefore reveal the molecular basis of Pol I selection for ribosome biogenesis. As well, they reveal an unexpected potential within the histone fold as a motif for specific protein-DNA interactions inside the cell.

Abstract Autophagy-related protein 18 (Atg18) participates in the elongation of early autophagosomal structures in concert with Atg2 and Atg9 complexes. How Atg18 contributes to the structural coordination of Atg2 and Atg9 at the isolation membrane remains to be understood. Here, we determined the cryo-EM structures of Atg18 organized in helical tubes as well as soluble oligomers. The helical assembly is composed of Atg18 tetramers forming a lozenge cylindrical lattice with remarkable structural similarity to the COPII outer coat. When reconstituted with lipid membranes, using subtomogram averaging we determined tilted Atg18 dimer structures bridging two juxtaposed lipid membranes spaced apart by 80 Å. Together with an AlphaFold Atg18-Atg2 model, we propose that Atg18 oligomers form a structural scaffold coordinating the Atg2 membrane bridge. The observed structural plasticity of Atg18’s oligomeric organization and membrane binding provide a molecular framework for the positioning of downstream components of the autophagy machinery.

Abstract Our understanding of protein synthesis has been conceptualised around the structure and function of the bacterial ribosome 1–4 . This complex macromolecular machine is the target of important antimicrobial drugs 5 , an integral line of defence against infectious diseases. Here, we describe how open access to state-of-the-art cryogenic electron microscopy facilities combined with bespoke user support offered by the newly established EMBL Imaging Centre enabled structural determination of the translating ribosome from Escherichia coli at 1.55 Å resolution. The obtained structures allow for direct determination of the rRNA sequence to identify ribosome polymorphism sites in the E. coli strain used in this study and enables interpretation of the ribosomal active and peripheral sites at unprecedented resolution. This includes scarcely populated chimeric hybrid states of the ribosome engaged in several tRNA translocation steps resolved at ~2 Å resolution. The current map not only improves our understanding of protein synthesis but also allows for more precise structure-based drug design of antibiotics to tackle rising bacterial resistance.

In cryo-electron microscopy structure determination, embedding biomolecules in vitreous ice of optimal thickness is critical. Ice thickness assessment and selection of suitable holes for data collection are currently part of time-consuming preparatory routines performed on expensive electron microscopes. For this reason, we developed a method to determine ice thickness during sample preparation using the optical camera integrated in the VitroJet. As a result, the ice thickness of buffer-suspended holes on an EM grid can be determined faithfully in the working range relevant for single particle cryo-EM. Dependent on the thickness, the error is below +- 20 nm in the range between 0 - 70 nm down to +- 10 nm in the thinnest ice regions (10 - 40 nm). Single particle structures of apoferritin were determined at two distinct thicknesses of 30 nm and 70 nm to demonstrate the suitability of optical layer thickness measurements for time-efficient cryo-EM structure determination.

The mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) couples cell growth to nutrient, energy and growth factor availability (1–3). mTORC1 is activated at the lysosomal membrane when amino acids are replete via the Rag guanosine triphosphatases (GTPases) (4–6). Rags exist in two stable states, an inactive (RagA/B GDP :RagC/D GTP ) and active (RagA/B GTP :RagC/D GDP ) state, during low and high cellular amino acid levels (4, 5). The lysosomal folliculin (FLCN) complex (LFC) consists of the inactive Rag dimer, the pentameric scaffold Ragulator (7, 8), and the FLCN:FNIP (FLCN-interacting protein) GTPase activating protein (GAP) complex (9), and prevents activation of the Rag dimer during amino acid starvation (10, 11). How the LFC is released upon amino acid refeeding is a major outstanding question in amino-acid dependent Rag activation. Here we show that the cytoplasmic tail of the lysosomal solute carrier family 38 member 9 (SLC38A9), a known Rag activator (12–14), destabilizes the LFC. By breaking up the LFC, SLC38A9 triggers the GAP activity of FLCN:FNIP toward RagC. We present the cryo electron microscopy (cryo-EM) structures of Rags in complex with their lysosomal anchor complex Ragulator and the cytoplasmic tail of SLC38A9 in the pre and post GTP hydrolysis state of RagC, which explain how SLC38A9 destabilizes the LFC and so promotes Rag dimer activation.

The pathological deposition of proteins is a hallmark of several devastating neurodegenerative diseases. These pathological deposits comprise aggregates of proteins that adopt distinct structures named strains. However, the molecular factors responsible for the formation of distinct aggregate strains are unknown. Here we show that the serine/threonine kinase GSK3β catalyzes the aggregation of the protein tau into an AD-like amyloid strain. We demonstrate that phosphorylation by GSK3β, but not by several other kinases, promotes the aggregation of full-length tau through enhanced phase separation into gel-like condensate structures. Cryo-electron microscopy further reveals that the amyloid fibrils formed by GSK3β-phosphorylated tau adopt a fold comparable to that of paired helical filaments isolated from the brains of AD patients. Our results elucidate the intricate relationship between post-translational modification and the formation of tau strains in neurodegenerative diseases.

Abstract mTORC1 regulates cell growth and catabolism in response to fluctuations in nutrients through phosphorylation of key substrates. The tumor suppressor FLCN is a RagC GTPase activating protein (GAP) that regulates mTORC1 phosphorylation of TFEB, controlling lysosome biogenesis and autophagy. Here, we determined the cryo-EM structure of the active FLCN complex (AFC) containing FLCN, FNIP2, the N-terminal tail of SLC38A9, the RagA GDP :RagC GDP.BeFx- GTPase dimer, and the Ragulator scaffold. Relative to the inactive lysosomal FLCN complex (LFC) structure, FLCN reorients by 90°, breaks its contacts with RagA, and makes new contacts with RagC that position its Arg164 finger for catalysis. Disruption of the AFC-specific interfaces of FLCN and FNIP2 with RagC eliminated GAP activity in vitro and led to nuclear retention of TFE3, with no effect on mTORC1 phosphorylation of S6K or 4E-BP1. The structure thus provides a roadmap to discover TFEB-selective mTORC1 antagonists. One-Sentence Summary The cryo-EM structure of the active FLCN RagC GAP complex provides a structural basis for TFEB/TFE3 substrate-selective targeting of mTORC1.