Pyroptosis executor Gasdermin (GsdmD) promotes atherosclerosis in mice and humans. Disulfiram (DSF) was recently shown to potently inhibit GsdmD, but the in-vivo efficacy and mechanism of DSF's anti-atherosclerotic activity is yet to be explored. We used human/mouse macrophages and a hyperlipidemic mouse model of atherosclerosis to determine DSF anti-atherosclerotic efficacy and mechanism. DSF-fed hyperlipidemic apoE-/- mice showed significantly reduced IL-1b release upon in-vivo Nlrp3 inflammasome assembly and showed smaller atherosclerotic lesions (~27% and 29% reduction in males and females, respectively). The necrotic core area was also smaller (~50% and 46% reduction in DSF-fed males and females, respectively). DSF induced autophagy in macrophages, hepatocytes/liver, and in atherosclerotic plaques. DSF modulated other atheroprotective pathways such as efferocytosis, phagocytosis, and gut microbiota. DSF-treated macrophages showed enhanced phagocytosis/efferocytosis, with a mechanism being a marked increase in cell-surface expression of efferocytic receptor MerTK. Atomic-force microscopy analysis revealed altered biophysical membrane properties of DSF treated macrophages, showing increased ordered-state of the plasma membrane and increased adhesion strength. Furthermore, the 16sRNA sequencing of DSF-fed hyperlipidemic mice showed highly significant enrichment in atheroprotective gut microbiota Akkermansia and a reduction in atherogenic Romboutsia species. Taken together, our data shows that DSF can simultaneously modulate multiple atheroprotective pathways, and thus may serve as novel adjuvant therapeutic to treat atherosclerosis.

Bacterial membrane vesicles (MVs) facilitate the long-distance delivery of virulence factors crucial for pathogenicity. The entry and trafficking mechanisms of virulence factors inside host cells are recently emerging; however, whether bacterial MVs can fuse and modulate the physicochemical properties of the host lipid membrane and membrane lipid parameter for fusion remains unknown. In this study, we reconstituted the interaction of bacterial MVs with host cell lipid membranes and quantitatively showed that bacterial MV interaction increases the fluidity, dipole potential, and compressibility of a biologically relevant multicomponent host membrane upon fusion. The presence of cylindrical lipids, such as phosphatidylcholine, and a moderate acyl chain length of C16 help the MV interaction. While significant binding of bacterial MVs to the raft-like lipid membranes with phase-separated regions of the membrane was observed, however, MVs prefer binding to the liquid-disordered regions of the membrane. Furthermore, the elevated levels of cholesterol tend to hinder the interaction of bacterial MVs, as evident from the favorable excess Gibbs free energy of mixing bacterial MVs with host lipid membranes. The findings provide new insights that might have implications for the regulation of host machinery by bacterial pathogens through manipulation of the host membrane properties.

Background: Human mutations in ATP8b1, a member of the P4-type ATPase family, cause Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis I (PFIC1). PFIC1 patients often show extrahepatic inflammatory manifestations such as atherosclerosis, pancreatitis, and hearing loss. Even after liver transplantation, which rescues PFIC1 hepatic symptoms, the extrahepatic inflammatory symptoms persist. The mechanism of how ATP8b1 regulates inflammation is not clear. Pyroptosis executor Gasdermin D (GsdmD) plays a major role in promoting inflammation. GsdmD can be cleaved via a caspase-1/Nlrp3 dependent canonical inflammasome pathway, or a caspase-11 (in mice) or caspase-4/5 (in humans) dependent non-canonical inflammasome pathway. Goal: To decipher the mechanism for ATP8b1-mediated regulation of inflammasome activity in immune cells. Methods & Results: We employed Crispr-Cas9 generated homozygous ATP8b1 knockout human monocytes/macrophages to determine the status of inflammasome activity. Human monocytes/macrophages lacking ATP8b1 released significantly more IL-1β upon exposure to LPS (1μg/ml) + Nigericin (5 mM) vs. control cells (mean±SD, N=3-6, p<0.0001 by t-test.) Interestingly, ATP8b1 -/- cells showed GsdmD cleavage with LPS priming alone without a secondary signal, and markedly increased IL-1β release vs. WT cells (N=3-6, mean±SD, p<0.001). Mechanistically, LPS gained cytoplasmic access in ATP8b1 -/- immune cells, leading to cleavage of GsdmD in an NLRP3-independent, and caspase 4/5 dependent non-canonical inflammasome. The ATP8b1 -/- immune cells showed impaired lysosomal acidification, though the lysosomal number and lysosomal membrane integrity were not compromised. ATP8b1 -/- immune cells showed defects in inflammasome-resolving pathways such as phagocytosis and efferocytosis. Atomic force microscopy of ATP8b1 -/- cells showed a reduced order state of the plasma membrane with Young’s modulus of elasticity for THP-1 ATP8b1 -/- (Ey= 296±10.42 Pa) vs. WT macrophages (Ey =680±25.27 Pa, N =30, mean±SD, p<0.0001). Conclusions: ATP8b1 negatively regulates GsdmD cleavage via a non-canonical inflammasome pathway. GsdmD may serve as a therapeutic target for resolving inflammation in PFIC1 patients.

Bacterial membrane vesicles (MVs) facilitate long-distance delivery of virulence factors crucial for pathogenicity. The entry and trafficking mechanisms of virulence factors inside host cells is recently emerging, however, if bacterial MVs modulate the physicochemical properties of the host lipid membrane remains unknown. Here we reconstitute the interaction of bacterial MV with host cell lipid membranes and quantitatively show that bacterial MV interaction increases the fluidity, dipole potential and elasticity of a biologically relevant multi-component host membrane. The presence of cylindrical lipids such as phosphatidylcholine and phosphatidylinositol and a moderate acyl chain length of C16 helps the MV interaction. While significant binding of bacterial MVs to the raft-like lipid membranes with phase separated regions of the membrane was observed, however, MVs have a preference for binding to the liquid disordered regions of the membrane. Further, the elevated levels of cholesterol tend to hinder the interaction of bacterial MVs. We further quantify the change in excess Gibbs free energy of mixing of bacterial MVs with host lipid membranes driving the modulation of host membrane parameters. The findings may have significant implications on the regulation of host machineries by pathogen through manipulation of host membrane properties.Significance Statement Bacterial membrane vesicles (MVs) act as the long-distance delivery tools for virulence factor and thus, directly implicated in host-pathogen interactions and pathogenicity. While the mechanisms of virulence transfer is only recently emerging, however, the interaction of MVs the host cell membrane remains largely unexplored. Whether the MVs interaction can locally modulate the host lipid membrane physicochemical properties (such as fluidity, dipole potential and elasticity) remains unknown. Here, we quantitatively investigate the lipid specificity of E. Coli MV interaction and this results in increase in the fluidity, dipole potential and in-plane elasticity of a biologically relevant multi-component host membrane. The findings could be important for numerous cell-signaling processes as well as downstream events involving membrane-membrane fusion during process of phagosome maturation.