EZ Inhibition Missense mutations in the core constituents of the genome packaging material, chromatin, have been implicated in several of human cancers. Nucleosomes are made up of histones, and a mutation of lysine 27 (K27) to methionine in the N-terminal tail of histone variants H3.3 and H3.1 has been identified in various pediatric gliomas. Lewis et al. (p. 857 , published online 28 March; see the Perspective by Morgan and Shilatifard ) show that the polycomb enzyme complex, which can epigenetically modify K27 by addition of a methyl group—and which is often a silencing signal—is itself potently inhibited by replacement of the H3.3/3.1 K27 by methionine. The inhibition of the EZH2 subunit causes an overall reduction of K27 methylation. Methionine mutants of other methylated lysine residues in histone H3 cause similar reductions in methylation levels of the cognate lysine, altering the epigenetic profiles of such cancer cells.

Cynthia Hawkins, Oren Becher and colleagues report the identification of recurrent mutations in ACVR1 in 20% of diffuse intrinsic pontine gliomas. Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) is a fatal brain cancer that arises in the brainstem of children, with no effective treatment and near 100% fatality. The failure of most therapies can be attributed to the delicate location of these tumors and to the selection of therapies on the basis of assumptions that DIPGs are molecularly similar to adult disease. Recent studies have unraveled the unique genetic makeup of this brain cancer, with nearly 80% found to harbor a p.Lys27Met histone H3.3 or p.Lys27Met histone H3.1 alteration. However, DIPGs are still thought of as one disease, with limited understanding of the genetic drivers of these tumors. To understand what drives DIPGs, we integrated whole-genome sequencing with methylation, expression and copy number profiling, discovering that DIPGs comprise three molecularly distinct subgroups (H3-K27M, silent and MYCN) and uncovering a new recurrent activating mutation affecting the activin receptor gene ACVR1 in 20% of DIPGs. Mutations in ACVR1 were constitutively activating, leading to SMAD phosphorylation and increased expression of the downstream activin signaling targets ID1 and ID2. Our results highlight distinct molecular subgroups and novel therapeutic targets for this incurable pediatric cancer.

Medulloblastomas are brain tumors that arise in the cerebellum of children and contain stem cells in a perivascular niche thought to give rise to recurrence following radiation. We used several mouse models of medulloblastomas in parallel to better understand how the critical cell types in these tumors respond to therapy. In our models, the proliferating cells in the tumor bulk undergo radiation-induced, p53-dependent apoptotic cell death. Activation of Akt signaling via PTEN loss transforms these cells to a nonproliferating extensive nodularity morphology. By contrast, the nestin-expressing perivascular stem cells survive radiation, activate PI3K/Akt pathway, undergo p53-dependent cell cycle arrest, and re-enter the cell cycle at 72 h. Furthermore, the ability of these cells to induce p53 is dependent on the presence of PTEN. These cellular characteristics are similar to human medulloblastomas. Finally, inhibition of Akt signaling sensitizes cells in the perivascular region to radiation-induced apoptosis.

Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) is the main cause of brain tumour-related death in children. In the majority of cases diagnosis is based on clinical and MRI findings, resulting in the scarcity of pre-treatment specimens available to study. Our group has developed an autopsy-based protocol to investigate the histologic and biologic spectrum of DIPG. This has also allowed us to investigate the terminal pattern of disease and gain a better understanding of what challenges we are facing in treating DIPG. Here, we review 72 DIPG cases with well documented clinical history and molecular data and describe the pathological features of this disease in relation to clinical and genetic features. Fifty-three of the samples were autopsy material (7 pre-treatment) and 19 were pre-treatment biopsy/surgical specimens. Upon histological review, 62 patients had high-grade astrocytomas (18 WHO grade III and 44 WHO grade IV patients), 8 had WHO grade II astrocytomas, and 2 had features of primitive neuroectodermal tumour (PNET). K27M-H3 mutations were exclusively found in tumours with WHO grade II–IV astrocytoma histology. K27M-H3.1 and ACVR1 mutations as well as ALT phenotype were only found in WHO grade III–IV astrocytomas, while PIK3CA mutations and PDGFRA gains/amplifications were found in WHO grade II–IV astrocytomas. Approximately 1/3 of DIPG patients had leptomeningeal spread of their tumour. Further, diffuse invasion of the brainstem, spinal cord and thalamus was common with some cases showing spread as distant as the frontal lobes. These findings suggest that focal radiation may be inadequate for some of these patients. Importantly, we show that clinically classic DIPGs represent a diverse histologic spectrum, including multiple cases which would fit WHO criteria of grade II astrocytoma which nevertheless behave clinically as high-grade astrocytomas and harbour the histone K27M-H3.3 mutation. This suggests that the current WHO astrocytoma grading scheme may not appropriately predict outcome for paediatric brainstem gliomas.

Malignant gliomas remain the most devastating childhood and adult tumors of the central nervous system. Although adult and pediatric gliomas are histologically indistinguishable, they differ in location, behavior, and molecular characteristics. This implies that the molecular pathways and pathophysiology of malignant gliomagenesis in these two populations are distinct. Such differences between adult and pediatric gliomas may predict different therapeutic responses. Therefore, accurate genetically engineered models of adult and pediatric gliomas may help understand the biology of these tumors and evaluate therapeutic agents in preclinical studies. It has been proposed that gliomas arise from the subventricular zone in mice during development. Here, we demonstrate that, in adult mice, gliomas may arise not only when injected in the subventricular zone but also when injected in the cortex and cerebellum. Our work demonstrates a versatile and highly reproducible adult mouse model of glioma, which can be easily incorporated into preclinical studies.

We report a comprehensive proteogenomics analysis, including whole-genome sequencing, RNA sequencing, and proteomics and phosphoproteomics profiling, of 218 tumors across 7 histological types of childhood brain cancer: low-grade glioma (n = 93), ependymoma (32), high-grade glioma (25), medulloblastoma (22), ganglioglioma (18), craniopharyngioma (16), and atypical teratoid rhabdoid tumor (12). Proteomics data identify common biological themes that span histological boundaries, suggesting that treatments used for one histological type may be applied effectively to other tumors sharing similar proteomics features. Immune landscape characterization reveals diverse tumor microenvironments across and within diagnoses. Proteomics data further reveal functional effects of somatic mutations and copy number variations (CNVs) not evident in transcriptomics data. Kinase-substrate association and co-expression network analysis identify important biological mechanisms of tumorigenesis. This is the first large-scale proteogenomics analysis across traditional histological boundaries to uncover foundational pediatric brain tumor biology and inform rational treatment selection.

Abstract Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) kills more children than any other type of brain tumor. Despite clinical trials testing many chemotherapeutic agents, radiotherapy remains the standard treatment. Here, we utilized Cre/loxP technology to show that deleting Ataxia telangiectasia mutated ( Atm ) in primary mouse models of DIPG can enhance tumor radiosensitivity. Genetic deletion of Atm improved survival of mice with p53 deficient but not p53 wild-type gliomas following radiotherapy. Similar to patients with DIPG, mice with p53 wild-type tumors had improved survival after radiotherapy independent of Atm deletion. p53 wild-type tumor cell lines induced proapoptotic genes after radiation and repressed the NRF2 target, Nqo1 . Tumors lacking p53 and Ink4a/Arf expressed the highest level of Nqo1 and were most resistant to radiation, but deletion of Atm enhanced the radiation response. These results suggest that tumor genotype may determine whether inhibition of ATM during radiotherapy will be an effective clinical approach to treat DIPGs.

ABSTRACT BACKGROUND Diffuse midline gliomas remain incurable, with consistently poor outcomes in children despite radiotherapy. Immunotherapeutic approaches hold promise, with the integration of the host’s immune system fundamental to their design. Here, we describe a new, genetically engineered immunocompetent model that incorporates interleukin 13 receptor alpha 2 (IL13Rα2), a tumor-associated antigen, which is suitable for further evaluation of the antitumor activity of IL13Rα2-targeted immunotherapeutics in preclinical studies. METHODS The RCAS-Tv-a delivery system was used to induce gliomagenesis through overexpression of PDGFB and p53 deletion with and without human IL13Rα2 in Nestin-Tva; p53 fl/fl mice. Hindbrain or cerebral cortex nestin progenitors of neonatal pups were infected with Cre recombinase and PDGFB+IL13Rα2 or Cre recombinase and PDGFB to model diffuse midline glioma and supratentorial high-grade glioma, respectively. Immunoblotting and flow cytometry was used to confirm target expression. Kaplan-Meier survival curves were established to compare tumor latency in both models. Tumor tissue was analyzed through immunohistochemistry and H&E staining. Cell lines generated from tumor-bearing mice were used for in vitro studies and orthotopic injections. RESULTS The protein expression of PDGFB and IL13Rα2 was confirmed by flow cytometry and western blot. In both groups, de novo tumors developed without significant difference in median survival between PDGFB and p53 loss (n=25, 40 days) and PDGFB, IL13Rα2, and p53 loss (n=33, 38 days, p=0.62). Tumors demonstrated characteristics of high-grade glioma such as infiltration, palisading necrosis, microvascular proliferation, high Ki-67 index, heterogeneous IL13Rα2 expression, and CD11b+ macrophages, along with a low proportion of CD3+ T cells. Orthotopic tumors developed from cell lines retained histopathological characteristics of de novo tumors. Mice orthotopically implanted with cells in the hindbrain or right cortex showed a median survival of 42 days and 41 (p=0.56) days, respectively. CONCLUSION Generation of de novo tumors using the RCAS-Tv-a delivery system was successful, with tumors possessing histopathologic features common to pediatric diffuse gliomas. The development of these models opens the opportunity for preclinical assessment of IL13Rα2-directed immunotherapies with the potential for clinical translation.

Abstract Diffuse midline gliomas arise in the brainstem and other midline brain structures and cause a large proportion of childhood brain tumor deaths. Radiation therapy is the most effective treatment option, but these tumors ultimately progress. Inhibition of the phosphoinositide-3-kinase (PI3K)-like kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM), which orchestrates the cellular response to radiation-induced DNA damage, may enhance the efficacy of radiation therapy. Diffuse midline gliomas in the brainstem contain loss-of-function mutations in the tumor suppressor PTEN , or functionally similar alterations in the phosphoinositide-3-kinase (PI3K) pathway, at moderate frequency. Here, we sought to determine if Atm inactivation could radiosensitize a primary mouse model of brainstem glioma driven by Pten loss. Using Cre/loxP recombinase technology and the RCAS/TVA retroviral gene delivery system, we established a mouse model of brainstem glioma driven by Pten deletion. We find that Pten -null brainstem gliomas are relatively radiosensitive at baseline. In addition, we show that deletion of Atm in the tumor cells does not extend survival of mice bearing Pten -null brainstem gliomas after focal brain irradiation. These results characterize a novel primary mouse model of PTEN -mutated brainstem glioma and provide insights into the mechanism of radiosensitization by Atm deletion, which may guide the design of future clinical trials. Brief Summary We develop a mouse model of PTEN -mutated brainstem glioma and find that perturbation of the ATM does not enhance radiation efficacy in this model.

Background: Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) is an incurable pediatric brain tumor. Mutations in the H3 histone tail (H3.1/3.3-K27M) are a feature of DIPG, potentially rendering them therapeutically sensitive to small-molecule inhibition of chromatin modifiers. Pharmacological inhibition of lysine specific demethylase-1 (LSD1) shows promise in pediatric cancers such as Ewings sarcoma, but has not been investigated in DIPG, which was the aim of our study. Methods: Patient-derived DIPG cell lines and pediatric high-grade glioma (pHGG) datasets were used to evaluate effects of several LSD1 inhibitors on selective cytotoxicity and immune gene expression. Immune cell cytotoxicity was assessed in DIPG cells treated with LSD1 inhibitors and informatics platforms were used to determine immune infiltration of pHGG and impact on survival. Results: Selective cytotoxicity and an immunogenic gene signature was established in DIPG lines using several clinically-relevant LSD1 inhibitors. Pediatric high-grade glioma patient sequencing data demonstrated survival benefit using this LSD1-dependent gene signature. On-target binding of catalytic LSD1 inhibitors was confirmed in DIPG and pre-treatment of DIPG with these inhibitors increased lysis by natural killer (NK) cells. CIBERSORT analysis of patient data confirmed NK infiltration is beneficial to patient survival while CD8 T-cells are negatively prognostic. Catalytic LSD1 inhibitors are non-perturbing to NK cells while scaffolding LSD1 inhibitors are toxic to NK cells and do not induce the gene signature in DIPG cells. Conclusions: LSD1 inhibition using catalytic inhibitors are both selectively cytotoxic and promote an immune gene signature that is associated with NK cell killing, representing a therapeutic opportunity for pHGG.