// Yuchen Jiao 1,* , Patrick J. Killela 2,* , Zachary J. Reitman 2,* , B. Ahmed Rasheed 2 , Christopher M. Heaphy 1 , Roeland F. de Wilde 1 , Fausto J. Rodriguez 1 , Sergio Rosemberg 3 , Sueli Mieko Oba-Shinjo 3 , Suely Kazue Nagahashi Marie 3 , Chetan Bettegowda 1 , Nishant Agrawal 1 , Eric Lipp 2 , Christopher J. Pirozzi 2 , Giselle Y. Lopez 2 , Yiping He 2 , Henry S. Friedman 2 , Allan H. Friedman 2 , Gregory J. Riggins 1 , Matthias Holdhoff 1,4 , Peter Burger 1 , Roger E. McLendon 2 , Darell D. Bigner 2 , Bert Vogelstein 1 , Alan K. Meeker 1 , Kenneth W. Kinzler 1 , Nickolas Papadopoulos 1 , Luis A. Diaz Jr 1,4 , Hai Yan 2 1 Ludwig Center for Cancer Genetics and Howard Hughes Medical Institutions, The Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, the Department of Oncology, the Department of Pathology, the Department of Neurosurgery, the Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland, USA 2 The Preston Robert Tisch Brain Tumor Center at Duke, The Pediatric Brain Tumor Foundation Institute, the Department of Pathology, the Department of Surgery, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA 3 The Department of Pathology, the Department of Neurology, School of Medicine, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil 4 The Swim Across America Laboratory at Johns Hopkins, The Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland, USA * Denotes equal contribution Correspondence: Hai Yan, email: // Luis Diaz, email: // Keywords : ALT, IDH1, IDH2, Mixed Gliomas Received : July 31, 2012, Accepted : August 2, 2012, Published : August 3, 2012 Abstract Mutations in the critical chromatin modifier ATRX and mutations in CIC and FUBP1 , which are potent regulators of cell growth, have been discovered in specific subtypes of gliomas, the most common type of primary malignant brain tumors. However, the frequency of these mutationsin many subtypes of gliomas, and their association with clinical features of the patients, is poorly understood. Here we analyzed these loci in 363 brain tumors. ATRX is frequently mutated in grade II-III astrocytomas (71%), oligoastrocytomas (68%), and secondary glioblastomas (57%), and ATRX mutations are associated with IDH1 mutations and with an alternative lengthening of telomeres phenotype. CIC and FUBP1 mutations occurred frequently in oligodendrogliomas (46% and 24%, respectively) but rarely in astrocytomas or oligoastrocytomas (<10%). This analysis allowed us to define two highly recurrent genetic signatures in gliomas: IDH1/ATRX (I-A) and IDH1/CIC/FUBP1 (I-CF). Patients with I-CF gliomas had a significantly longer median overall survival (96 months) than patients with I-A gliomas (51 months) and patients with gliomas that did not harbor either signature (13 months). The genetic signatures distinguished clinically distinct groups of oligoastrocytoma patients, which usually present a diagnostic challenge, and were associated with differences in clinical outcome even among individual tumor types. In addition to providing new clues about the genetic alterations underlying gliomas, the results have immediate clinical implications, providing a tripartite genetic signature that can serve as a useful adjunct to conventional glioma classification that may aid in prognosis, treatment selection, and therapeutic trial design.

BACKGROUND: Malignant cells must maintain their telomeres, but genetic mechanisms responsible for telomere maintenance in tumors have only recently been discovered. In particular, mutations of the telomere binding proteins alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked (ATRX) or death-domain associated protein (DAXX) have been shown to underlie a telomere maintenance mechanism not involving telomerase (alternative lengthening of telomeres), and point mutations in the promoter of the telomerase reverse transcriptase (TERT) gene increase telomerase expression and have been shown to occur in melanomas. METHODS: To further define the tumor types in which TERT plays a role, we surveyed 1,230 tumors of 60 different types. We also analyzed the relationship between median overall survival (OS) of patients with IDH1/2 and TERT promoter mutations in a panel of 473 adult gliomas with the hypothesis that genetic signatures capable of distinguishing among several types of gliomas could be established providing clinically relevant information that can serve as an adjunct to histopathological diagnosis. RESULTS: We found that tumors could be divided into types with low and high frequencies of TERT promoter mutations. The nine TERT-high tumor types almost always originated in tissues with relatively low rates of self renewal, including melanomas, liposarcomas, hepatocellular carcinomas, urothelial carcinomas, squamous cell carcinomas of the tongue, medulloblastomas, and subtypes of gliomas. TERT and ATRX mutations were mutually exclusive, suggesting that these two genetic mechanisms confer equivalent selective growth advantages. We found that mutations in the TERT promoter occurred in 74.2% of glioblastomas (GBM), but occurred in a minority of Grade II-III astrocytomas (18.2%). In contrast, IDH1/2 mutations were observed in 78.4% of Grade II-III astrocytomas, but were uncommon in primary GBM. In oligodendrogliomas, TERT promoter and IDH1/2 mutations co-occurred in 79% of cases. Patients whose Grade III-IV gliomas exhibit TERT promoter mutations alone predominately have primary GBMs associated with poor median OS rates (11.5 months). Patients whose gliomas exhibit IDH1/2 mutations alone predominately have astrocytic morphologies and exhibit a median OS of 57 months while patients whose tumors exhibit both TERT promoter and IDH1/2 mutations predominately exhibit oligodendroglial morphologies and exhibit median OS of 125 months. CONCLUSIONS: In addition to their implications for understanding the relationship between telomeres and tumorigenesis, TERT mutations provide a biomarker that may aid in the classification and prognostication of brain tumors. SECONDARY CATEGORY: Tumor Biology.

Point mutations of the NADP + -dependent isocitrate dehydrogenases 1 and 2 (IDH1 and IDH2) occur early in the pathogenesis of gliomas. When mutated, IDH1 and IDH2 gain the ability to produce the metabolite ( R )-2-hydroxyglutarate (2HG), but the downstream effects of mutant IDH1 and IDH2 proteins or of 2HG on cellular metabolism are unknown. We profiled >200 metabolites in human oligodendroglioma (HOG) cells to determine the effects of expression of IDH1 and IDH2 mutants. Levels of amino acids, glutathione metabolites, choline derivatives, and tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates were altered in mutant IDH1- and IDH2-expressing cells. These changes were similar to those identified after treatment of the cells with 2HG. Remarkably, N -acetyl-aspartyl-glutamate (NAAG), a common dipeptide in brain, was 50-fold reduced in cells expressing IDH1 mutants and 8.3-fold reduced in cells expressing IDH2 mutants. NAAG also was significantly lower in human glioma tissues containing IDH mutations than in gliomas without such mutations. These metabolic changes provide clues to the pathogenesis of tumors associated with IDH gene mutations.

// Patrick J. Killela 1,* , Christopher J. Pirozzi 1,* , Patrick Healy 2 , Zachary J. Reitman 1 , Eric Lipp 1 , B. Ahmed Rasheed 1 , Rui Yang 1 , Bill H. Diplas 1 , Zhaohui Wang 1 , Paula K. Greer 1 , Huishan Zhu 1 , Catherine Y. Wang 1 , Austin B. Carpenter 1 , Henry Friedman 1 , Allan H. Friedman 1 , Stephen T. Keir 1 , Jie He 3 , Yiping He 1 , Roger E. McLendon 1 , James E. Herndon II 2 , Hai Yan 1 and Darell D. Bigner 1 1 Department of Pathology, Duke University Medical Center, The Preston Robert Tisch Brain Tumor Center at Duke, and Pediatric Brain Tumor Foundation Institute at Duke, Durham, NC, USA 2 Department of Biostatistics and Bioinformatics, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA 3 Department of Thoracic Surgery, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021, China * Denotes equal contribution Correspondence: Hai Yan, email: // Keywords : TERT promoter, IDH1, IDH2, Glioma Received : January 26, 2014 Accepted : January 28, 2014 Published : January 28, 2014 Abstract Frequent mutations in isocitrate dehydrogenase 1 and 2 ( IDH1 and IDH2 ) and the promoter of telomerase reverse transcriptase ( TERT ) represent two significant discoveries in glioma genomics. Understanding the degree to which these two mutations co-occur or occur exclusively of one another in glioma subtypes presents a unique opportunity to guide glioma classification and prognosis. We analyzed the relationship between overall survival (OS) and the presence of IDH1/2 and TERT promoter mutations in a panel of 473 adult gliomas. We hypothesized and show that genetic signatures capable of distinguishing among several types of gliomas could be established providing clinically relevant information that can serve as an adjunct to histopathological diagnosis. We found that mutations in the TERT promoter occurred in 74.2% of glioblastomas (GBM), but occurred in a minority of Grade II-III astrocytomas (18.2%). In contrast, IDH1/2 mutations were observed in 78.4% of Grade II-III astrocytomas, but were uncommon in primary GBM. In oligodendrogliomas, TERT promoter and IDH1/2 mutations co-occurred in 79% of cases. Patients whose Grade III-IV gliomas exhibit TERT promoter mutations alone predominately have primary GBMs associated with poor median OS (11.5 months). Patients whose Grade III-IV gliomas exhibit IDH1/2 mutations alone predominately have astrocytic morphologies and exhibit a median OS of 57 months while patients whose tumors exhibit both TERT promoter and IDH1/2 mutations predominately exhibit oligodendroglial morphologies and exhibit median OS of 125 months. Analyzing gliomas based on their genetic signatures allows for the stratification of these patients into distinct cohorts, with unique prognosis and survival.

Abstract Pediatric brain tumors including medulloblastoma and high-grade glioma are generally refractory to T cell-based immunotherapy, largely due to an immune-hostile microenvironment infiltrated extensively with immunosuppressive macrophages. Ultra-high dose rate (FLASH) radiotherapy holds promise for treating solid tumors, given the potential lower toxicity in normal tissues and possible favorable impact on tumor immunity. Using a genetically engineered mouse model of medulloblastoma and glioma, we show that FLASH radiation stimulates pro-inflammatory polarization in tumor macrophages. Single-cell transcriptome analysis shows that FLASH proton beam radiation skews macrophages towards proinflammatory phenotypes and increases T cell infiltration in the medulloblastoma model. Further bulk transcriptome analyses reveal that FLASH radiation reduces peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-γ and arginase-1 expression and inhibits immunosuppressive macrophage polarization under stimulus-inducible conditions. Mechanistically, FLASH radiation abrogates lipid oxidase expression and oxidized low-density lipid (oxLDL) generation to reduce PPARγ activity, while standard radiation induces reactive oxygen species (ROS)-dependent PPARγ activation in macrophages. Notably, FLASH radiotherapy improves infiltration and activation of chimeric antigen receptor (CAR) T cells and sensitizes tumors to GD2 CAR T immunotherapy in the autochthonous medulloblastoma and syngeneic glioma models. These findings suggest that FLASH radiotherapy may reprogram macrophage lipid metabolism to reverse tumor immunosuppression and that combination FLASH-CAR radioimmunotherapy may offer exciting opportunities for treatment of pediatric brain tumor.

Diffuse midline gliomas (DMGs) are lethal brain tumors characterized by p53-inactivating mutations and oncohistone H3.3K27M mutations that rewire the cellular response to genotoxic stress, which presents therapeutic opportunities. We used RCAS/tv-a retroviruses and Cre recombinase to inactivate p53 and induce K27M in the native H3f3a allele in a lineage- and spatially-directed manner, yielding primary mouse DMGs. Genetic or pharmacologic disruption of the DNA damage response kinase Ataxia-telangiectasia mutated (ATM) enhanced the efficacy of focal brain irradiation, extending mouse survival. This finding suggests that targeting ATM will enhance the efficacy of radiation therapy for p53-mutant DMG but not p53-wildtype DMG. We used spatial in situ transcriptomics and an allelic series of primary murine DMG models with different p53 mutations to identify transactivation-independent p53 activity as a key mediator of such radiosensitivity. These studies deeply profile a genetically faithful and versatile model of a lethal brain tumor to identify resistance mechanisms for a therapeutic strategy currently in clinical trials.

Abstract BACKGROUND For patients with glioblastoma, the identification of a non-invasive biomarker for longitudinal molecular profiling could improve risk stratification, clinical trial design, and surveillance. In a secondary analysis of the phase II randomized VERTU trial (ACTRN12615000407594) of adult patients with newly diagnosed MGMT-unmethylated glioblastoma, we assessed the feasibility of characterizing peripheral blood genome-wide DNA methylation patterns. METHODS DNA was extracted from whole blood and serum samples at baseline and end-of-treatment (EOT) from patients enrolled on VERTU, which evaluated the PARP inhibitor veliparib combined with radiotherapy and temozolomide. Infinium FFPE QC qPCR and DNA Restoration Kits were used to restore and concentrate fragmented serum DNA. Genomic DNA was plated, bisulfite converted, and profiled for methylation patterns at &gt;935,000 CpG sites using the Infinium MethylationEPIC microarray V2.0. Quality control, pre-processing, leukocyte deconvolution, and calling of MGMT status were completed in R Studio. RESULTS Peripheral blood methylation data were generated and passed quality control for 104/104 baseline and 24/34 EOT samples available for analysis. The median concentration of genomic DNA at baseline and EOT was 104.50 ng/μl (range:1.97-550) and 0.98 ng/μl (range:0.11-19.8). The deconvoluted median leukocyte proportions differed significantly between baseline and EOT for neutrophils (0.64vs0.90,p&lt;0.01), CD4 memory (0.09vs0.00,p&lt;0.01), CD4 naive (0.03vs0.01,p=0.02), CD8 memory (0.04vs0.00,p&lt;0.01), monocyte (0.07vs0.03,p&lt;0.01), natural killer (0.05vs0.00,p&lt;0.01), and T regulatory (0.000vs0.001,p=0.01) cells. There were no differences in baseline leukocyte proportions between patients with (n=6) and without (n=98) biopsy-proven pseudoprogression. 2/104 samples were determined to be MGMT-methylated based on peripheral blood methylation analysis. Unsupervised hierarchical clustering based on the 1,000 most differentially methylated CpG sites generated two patient clusters (n=64, n=40). CONCLUSIONS To our knowledge, this is the first study to demonstrate the feasibility of analyzing peripheral blood methylation patterns from patients with glioblastoma receiving chemoradiation on a randomized clinical trial. Efforts are underway to correlate these blood methylation patterns with previously published tumor tissue methylation patterns and clinical outcomes.

Abstract Outcomes for patients with brain metastases (BM) from targetable epidermal growth factor receptor (EGFR) mutated non-small cell lung cancer (NSCLC) have been improved with tyrosine kinase inhibitors (TKIs). However, outcomes following stereotactic radiosurgery (SRS) for NSCLC BM patients with other pathogenic EGFR mutations and variants remain uncertain. We sought to characterize outcomes for NSCLC BM patients with pathogenic variants (PV) or variants of uncertain significance (VUS) in EGFR following SRS. We retrospectively identified 600 NSCLC BM patients who underwent an initial course of SRS during 2015- 2020. Demographic, clinical, genomic, and treatment characteristics were recorded. Intracranial progression-free survival (ICP-FS) and overall survival (OS) were estimated via the Kaplan Meier method. Median follow up was 9.6 months. 155 (25.8%) patients had actionable mutations, including in EGFR (112). Of those with EGFR mutations, next-generation sequencing (NGS) data was available for 65 patients. In patients with targetable EGFR mutations, 39 received pre-SRS and 69 received post-SRS treatment with a TKI, typically with a 1st/2nd generation TKI. Most patients (n=12/13) with EGFR VUS received (chemo)immunotherapy. OS was significantly better for patients with any EGFR mutation/variant compared to patients without a detected variant (median 21.1 mos vs 8.1 mos, p&lt;0.0001), however, there was no difference in ICP-FS. Patients with EGFR VUS had improved OS and ICP-FS compared to EGFR PVs (median 56.3 mos vs 19 mos, p=0.022) and (median 53.1 mos vs 7.7 mos, p=0.041), respectively. While patients with EGFR mutation/variants demonstrated improvement in OS, ICP-FS was likely limited by use of early generation TKIs with SRS. Notably, there was compelling improvement in OS and ICP-FS associated with EGFR VUS, which is hypothesis generating and requires a larger cohort for further examination.

Abstract Diffuse midline gliomas arise in the brainstem and other midline brain structures and cause a large proportion of childhood brain tumor deaths. Radiation therapy is the most effective treatment option, but these tumors ultimately progress. Inhibition of the phosphoinositide-3-kinase (PI3K)-like kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM), which orchestrates the cellular response to radiation-induced DNA damage, may enhance the efficacy of radiation therapy. Diffuse midline gliomas in the brainstem contain loss-of-function mutations in the tumor suppressor PTEN , or functionally similar alterations in the phosphoinositide-3-kinase (PI3K) pathway, at moderate frequency. Here, we sought to determine if Atm inactivation could radiosensitize a primary mouse model of brainstem glioma driven by Pten loss. Using Cre/loxP recombinase technology and the RCAS/TVA retroviral gene delivery system, we established a mouse model of brainstem glioma driven by Pten deletion. We find that Pten -null brainstem gliomas are relatively radiosensitive at baseline. In addition, we show that deletion of Atm in the tumor cells does not extend survival of mice bearing Pten -null brainstem gliomas after focal brain irradiation. These results characterize a novel primary mouse model of PTEN -mutated brainstem glioma and provide insights into the mechanism of radiosensitization by Atm deletion, which may guide the design of future clinical trials. Brief Summary We develop a mouse model of PTEN -mutated brainstem glioma and find that perturbation of the ATM does not enhance radiation efficacy in this model.

Abstract Gangliogliomas are brain tumors composed of neuron-like and macroglia-like components that occur in children and young adults. Gangliogliomas are often characterized by a rare population of immature astrocyte-appearing cells expressing CD34, a marker expressed in the neuroectoderm (neural precursor cells) during embryogenesis. New insights are needed to refine tumor classification and to identify therapeutic approaches. We evaluated five gangliogliomas with single nucleus RNA-seq, cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing, and/or spatially-resolved RNA-seq. We uncovered a population of CD34+ neoplastic cells with mixed neuroectodermal, immature astrocyte, and neuronal markers. Gene regulatory network interrogation in these neuroectoderm-like cells revealed control of transcriptional programming by TCF7L2/MEIS1-PAX6 and SOX2, similar to that found during neuroectodermal/neural development. Developmental trajectory analyses place neuroectoderm-like tumor cells as precursor cells that give rise to neuron-like and macroglia-like neoplastic cells. Spatially-resolved transcriptomics revealed a neuroectoderm-like tumor cell niche with relative lack of vascular and immune cells. We used these high resolution results to deconvolute clinically-annotated transcriptomic data, confirming that CD34+ cell-associated gene programs associate with gangliogliomas compared to other glial brain tumors. Together, these deep transcriptomic approaches characterized a ganglioglioma cellular hierarchy - confirming CD34+ neuroectoderm-like tumor precursor cells, controlling transcription programs, cell signaling, and associated immune cell states. These findings may guide tumor classification, diagnosis, prognostication, and therapeutic investigations.