Abstract Circular RNAs (circRNAs) are abundantly expressed in cancer. Their resistance to exonucleases enables them to have potentially stable interactions with different types of biomolecules. Alternative splicing can create different circRNA isoforms that have different sequences and unequal interaction potentials. The study of circRNA function thus requires knowledge of complete circRNA sequences. Here we describe psirc, a method that can identify full-length circRNA isoforms and quantify their expression levels from RNA sequencing data. We confirm the effectiveness and computational efficiency of psirc using both simulated and actual experimental data. Applying psirc on transcriptome profiles from nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharynx samples, we discover and validate circRNA isoforms differentially expressed between the two groups. Compared to the assumed circular isoforms derived from linear transcript annotations, some of the alternatively spliced circular isoforms have 100 times higher expression and contain substantially fewer microRNA response elements, demonstrating the importance of quantifying full-length circRNA isoforms.

Cellular senescence, a stress-induced stable proliferation arrest associated with an inflammatory Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP), is a cause of aging. In senescent cells, Cytoplasmic Chromatin Fragments (CCFs) activate SASP via the anti-viral cGAS/STING pathway. PML protein organizes PML nuclear bodies (NBs), also involved in senescence and anti-viral immunity. The HIRA histone H3.3 chaperone localizes to PML NBs in senescent cells. Here, we show that HIRA and PML are essential for SASP expression, tightly linked to HIRA's localization to PML NBs. Inactivation of HIRA does not directly block expression of NF-κB target genes. Instead, an H3.3-independent HIRA function activates SASP through a CCF-cGAS-STING-TBK1-NF-κB pathway. HIRA physically interacts with p62/SQSTM1, an autophagy regulator and negative SASP regulator. HIRA and p62 co-localize in PML NBs, linked to their antagonistic regulation of SASP, with PML NBs controlling their spatial configuration. These results outline a role for HIRA and PML in regulation of SASP.

In this report, we present linked-pair sequencing, a novel strategy to construct a long-read sequencing library such that adjacent fragments are linked with end-terminal duplications. We use the CRISPR-Cas9 nickase enzyme and a pool of multiple sgRNAs to perform non-random fragmentation of targeted long DNA molecules (>300kb) into smaller library-sized fragments (about 20 kbp) in a manner so as to retain physical linkage information (up to 1000 bp) between adjacent fragments. DNA molecules targeted for fragmentation are preferentially ligated with adaptors for sequencing, so this method can enrich targeted regions while taking advantage of the long-read sequencing platforms. This enables the sequencing of target regions with significantly lower total coverage, and the genome sequence within linker regions provides information for assembly and phasing. We demonstrated the validity and efficacy of the method first using phage and then by sequencing a panel of 100 full-length cancer-related genes (including both exons and introns) in the human genome. When the designed linkers contained heterozygous genetic variants, long haplotypes could be established. This sequencing strategy can be readily applied in both PacBio and Oxford Nanopore platforms. This economically viable approach is useful for targeted enrichment of hundreds of target genomic regions and where long no-gap contigs need deep sequencing.

Cellular senescence, a stress-induced stable proliferation arrest associated with an inflammatory senescence-associated secretory phenotype (SASP), is a cause of aging. In senescent cells, cytoplasmic chromatin fragments (CCFs) activate SASP via the anti-viral cGAS/STING pathway. Promyelocytic leukemia (PML) protein organizes PML nuclear bodies (NBs), which are also involved in senescence and anti-viral immunity. The HIRA histone H3.3 chaperone localizes to PML NBs in senescent cells. Here, we show that HIRA and PML are essential for SASP expression, tightly linked to HIRA's localization to PML NBs. Inactivation of HIRA does not directly block expression of nuclear factor κB (NF-κB) target genes. Instead, an H3.3-independent HIRA function activates SASP through a CCF-cGAS-STING-TBK1-NF-κB pathway. HIRA physically interacts with p62/SQSTM1, an autophagy regulator and negative SASP regulator. HIRA and p62 co-localize in PML NBs, linked to their antagonistic regulation of SASP, with PML NBs controlling their spatial configuration. These results outline a role for HIRA and PML in the regulation of SASP.

K-mer counting has many applications in sequencing data processing and analysis. However, sequencing errors can produce many false k-mers that substantially increase the memory requirement during counting. We propose a fast k-mer counting method, CQF-deNoise, which has a novel component for dynamically identifying and removing false k-mers while preserving counting accuracy. Compared with four state-of-the-art k-mer counting methods, CQF-deNoise consumed 49-76% less memory than the second best method, but still ran competitively fast. The k-mer counts from CQF-deNoise produced cell clusters from single-cell RNA-seq data highly consistent with CellRanger but required only 5% of the running time at the same memory consumption, suggesting that CQF-deNoise can be used for a preview of cell clusters for an early detection of potential data problems, before running a much more time-consuming full analysis pipeline.