Abstract Spatial transcriptomics technology has revolutionized our understanding of cell types and tissue organization, opening new possibilities for researchers to explore transcript distributions at subcellular levels. However, existing methods have limitations in resolution, sensitivity, or speed. To overcome these challenges, we introduce SPRINTseq (Spatially Resolved and signal-diluted Next-generation Targeted sequencing), an innovative in situ sequencing strategy that combines hybrid block coding and molecular dilution strategies. Our method enables fast and sensitive high-resolution data acquisition, as demonstrated by recovering over 142 million transcripts using a 108 gene panel from 453,843 cells from four mouse brain coronal slices in less than two days. Using this advanced technology, we uncover the cellular and subcellular molecular architecture of Alzheimer’s disease, providing additional information into abnormal cellular behaviors and their subcellular mRNA distribution. This improved spatial transcriptomics technology holds great promise for exploring complex biological processes and disease mechanisms.

Abstract High-throughput sequencing technologies generate a vast number of DNA sequence reads simultaneously, which are subsequently analyzed using the information contained within these fragmented reads. The assessment of sequencing technology relies on information efficiency, which measures the amount of information entropy produced per sequencing reaction cycle. In this study, we propose a fuzzy sequencing strategy that exhibits information efficiency more than twice of currently prevailing cyclic reversible terminator sequencing methods. To validate our approach, we developed a fully functional and high-throughput fuzzy sequencer. This sequencer implements a highly efficient fluorogenic sequencing-by-synthesis chemistry and underwent testing across various application scenarios, including copy-number variation detection, noninvasive prenatal testing, transcriptome profiling, mutation genotyping, and metagenomic profling. Our findings unequivocally demonstrate that the fuzzy sequencing strategy outperforms existing methods in terms of information efficiency and delivers accurate resequencing results with faster turnaround times. One Sentence Summary A fuzzy sequencer can exceed current limit of information efficiency of DNA sequencers for resequencing applications.

Abstract To resolve many RNA species in situ, cyclic reactions are typically necessary to increase the multiplexity since conventional fluorescence microscopy is often limited to five channels. Therefore, sophisticated instrumentation is needed to perform in-situ sequencing or sequential fluorescence insitu hybridization imaging, restricting the widespread adoption of spatial RNA imaging methods among biological research communities. Here, we present ‘Profiling of RNA In-situ through Single-round of iMaging’ (PRISM), which leverages the spectral intensity levels to expand the coding capacity. With a radius vector coding strategy to ensure the orthogonality of codewords, PRISM can reach up to 64-plex RNA imaging in a single imaging shot with conventional microscopes. As a panel-based spatial transcriptomic imaging approach, the entire experimental process can be completed within one day. We verified PRISM’s versatility on various tissues, such as mouse brains, mouse embryos, and human hepatocellular carcinoma (HCC) samples, generating more than 5.7 million annotated cells. We performed quasi-3D spatial landscapes to track major cell types in different organs during embryonic development from E12.5 to E14.5. We also revealed the critical role of cancer-associated fibroblasts (CAFs) on immune infiltration and immune response heterogeneity within and between tumor microenvironments. We extended PRISM to 100-µm thick mouse brain slices to generate accurate 3D cell atlas and subcellular RNA localization landscapes. PRISM is robust and easy to operate, with a fast turnaround time and sub-cellular resolution, offering a new transcriptomic imaging toolbox for all biologists.