ABSTRACT RNases perform indispensable functions in regulating gene expression in many bacterial pathogens by processing and/or degrading RNAs. Despite the pivotal role of RNases in regulating bacterial virulence factors, the functions of RNases have not yet been studied in the major human respiratory pathogen Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). Here, we sought to determine the impact of two conserved RNases, the endoribonuclease RNase Y and exoribonuclease polynucleotide phosphorylase (PNPase), on the physiology and virulence of S. pneumoniae serotype 2 strain D39. We report that RNase Y and PNPase are essential for pneumococcal pathogenesis as both deletion mutants showed strong attenuation of virulence in murine models of invasive pneumonia. Genome-wide transcriptomic analysis revealed that nearly 200 mRNA transcripts were significantly up-regulated, whereas the abundance of several pneumococcal sRNAs, including the Ccn ( C iaR C ontrolled N oncoding RNA) sRNAs, were altered in the Δ rny mutant relative to the wild-type strain. Additionally, lack of RNase Y resulted in pleiotropic phenotypes that included defects in pneumococcal cell morphology and growth in vitro . In contrast, Δ pnp mutants showed no growth defect in vitro , but differentially expressed a total of 40 transcripts including the tryptophan biosynthesis operon genes and numerous 5’-cis-acting regulatory RNAs, a majority of which were previously shown to impact pneumococcal disease progression in mice using the serotype 4 strain TIGR4. Altogether our data suggest that RNase Y exerts a global impact on pneumococcal physiology, while PNPase-mediates virulence phenotypes, likely through sRNA regulation. IMPORTANCE Streptococcus pneumoniae is a notorious human pathogen that adapts to conditions in distinct host tissues and responds to host cell interactions by adjusting gene expression. Ribonucleases (RNases) are key players that modulate gene expression by mediating the turnover of regulatory and protein-coding transcripts. Here, we characterized two highly conserved RNases, RNase Y and PNPase, and evaluated their impact on the S . pneumoniae transcriptome for the first time. We show that PNPase influences the levels of a narrow set of mRNAs, but a large number of regulatory RNAs primarily implicated in virulence control, whereas RNase Y has a more sweeping effect on gene expression, altering levels of transcripts involved in diverse cellular processes including cell division, metabolism, stress response, and virulence. This study further reveals that RNase Y regulates expression of genes governing competence by mediating the turnover of C iaR- c ontrolled- n oncoding (Ccn) sRNAs.

Zinc is a vital transition metal for Streptococcus pneumoniae, but is deadly at high concentrations. Zn intoxication of S. pneumoniae results from a deficiency in Mn, which is required for key metabolic enzymes and defense against oxidative stress. Here, we report our identification and characterization of the function of the five homologous, CiaRH-regulated Ccn sRNAs in controlling S. pneumoniae virulence and metal homeostasis. We show that deletion of all five ccn genes (ccnA, ccnB, ccnC, ccnD, and ccnE) from S. pneumoniae strains D39 (serotype 2) and TIGR4 (serotype 4) causes Zn hypersensitivity and an attenuation of virulence in a murine invasive pneumonia model. We provide evidence that addition of Zn disproportionately impairs Mn uptake by the ΔccnABCDE mutants. Consistent with a response to Mn starvation, expression of genes encoding the CzcD Zn exporter and the Mn-independent ribonucleotide reductase, NrdD-NrdG, were increased in the ΔccnABCDE mutant relative to its isogenic ccn+ parent strain. The growth inhibition by Zn that occurs as the result of loss of the ccn genes is rescued by supplementation with Mn or OxyraseTM, a reagent that removes dissolved oxygen. Lastly, we found that the Zn-dependent growth inhibition of the ΔccnABCDE strain was not altered by deletion of sodA, whereas the ccn+ ΔsodA strain phenocopied the ΔccnABCDE strain. Overall, our results indicate that the Ccn sRNAs have a crucial role in preventing oxidative stress in S. pneumoniae during exposure to excess Zn by modulating Mn uptake.

ABSTRACT Post-transcriptional gene regulation often involves RNA-binding proteins that modulate mRNA translation and/or stability either directly through protein-RNA interactions or indirectly by facilitating the annealing of small regulatory RNAs (sRNAs). The human pathogen Streptococcus pneumoniae D39 (pneumococcus) does not encode homologs to RNA-binding proteins known to be involved in promoting sRNA stability and function, such as Hfq or ProQ, even though it contains genes for at least 112 sRNAs. However, the pneumococcal genome contains genes for other RNA-binding proteins, including at least six S1-domain proteins; ribosomal protein S1 ( rpsA ), polynucleotide phosphorylase (pnpA ), RNase R ( rnr ), and three proteins of unknown functions. Here, we characterize the function of one of these conserved, yet uncharacterized S1-domain proteins, SPD_1366, which we have renamed CvfD ( C onserved v irulence f actor D ), since loss of this protein results in an attenuation of virulence in a murine pneumonia model. We report that deletion of cvfD impacts expression of 144 transcripts including the pst1 operon, encoding the phosphate transport system 1 in S. pneumoniae . We further show that CvfD post-transcriptionally regulates the PhoU2 master regulator of the pneumococcal dual phosphate transport system by binding phoU2 mRNA and impacting PhoU2 translation. CvfD not only controls expression of phosphate transporter genes, but also functions as a pleiotropic regulator that impacts cold sensitivity and the expression of sRNAs and genes involved in diverse cellular functions, including manganese uptake and zinc efflux. Together, our data show that CvfD exerts a broad impact on pneumococcal physiology and virulence, partly by post-transcriptional gene regulation. SIGNIFICANCE Recent advances have led to the identification of numerous sRNAs in the major human respiratory pathogen, S. pneumoniae . However, little is known about the functions of most sRNAs or RNA-binding proteins involved in RNA biology in pneumococcus. In this paper, we characterize the phenotypes and one target of the S1-domain RNA-binding protein CvfD, a homolog of “general-stress protein 13” identified, but not extensively characterized in other Firmicute species. Pneumococcal CvfD is a broadly pleiotropic regulator, whose absence results in misregulation of divalent cation homeostasis, reduced translation of the PhoU2 master regulator of phosphate uptake, altered metabolism and sRNA amounts, cold sensitivity, and attenuation of virulence. These findings underscore the critical roles of RNA biology in pneumococcal physiology and virulence.