A promising route to tackle the trade-off in cellular resources between synthetic protein production and cellular growth is to use a separate dedicated pool of orthogonal ribosomes to produce synthetic proteins. However, the optimisation of strains containing two ribosomal pools - native for the host cell9s proteome and orthogonal for synthetic proteins - has yet to be thoroughly explored. Here, we address this by creating orthogonal ribosomes that fluoresce by inserting fluorescent RNA aptamers into tethered orthogonal ribosomal RNA (TO-rRNA). To study the tolerance of the engineered ribosomes to aptamer insertion, we assembled and screened a library of candidate insertion sites, identifying several sites in both the 16S and 23S TO-rRNA that enables ribosome labelling with minimal effect on translation activity. Serendipitously, we identify one site in 23S TO-rRNA, where insertion appears to not only be tolerated but to enhance orthogonal ribosome activity, across multiple bacterial strains and RNA insertions. Using bulk and single cell assays, we demonstrate that this variant allows us to label orthogonal ribosomes for dynamic tracking and across populations, making it a promising tool for optimising orthogonal translation in engineered cells. Ribosome engineering offers great potential, both for the development of next-generation microbial cell factories, as well as a tool to expand our understanding of ribosome function in living cells. This work provides a window into the assembly, localisation and function of these molecular machines to meet these aims.

Although directed evolution has been remarkably successful at expanding the chemical and functional boundaries of biology, it is limited by the robustness and flexibility of available selection platforms - traditionally designed around a single desired function with limited scope for alternative applications. We report SNAP as a quantitative reporter for bacterial cell display, which enabled fast troubleshooting and systematic development of the selection platform. In addition, we demonstrate that even weak interactions between displayed proteins and nucleic acids can be harnessed towards specific labelling of bacterial cells, allowing functional characterisation of DNA binding proteins and enzymes. Together, this establishes bacterial display as a viable route towards the systematic engineering of all ligands and enzymes required for the development of XNA molecular biology.

Abstract This paper presents a generalisable method for the calibration of fluorescence readings on microplate readers, in order to convert arbitrary fluorescence units into absolute units. FPCountR relies on the generation of bespoke fluorescent protein (FP) calibrants, assays to determine protein concentration and activity, and a corresponding analytical workflow. We systematically characterise the assay protocols for accuracy, sensitivity and simplicity, and describe a novel ‘ECmax’ assay that outperforms the others and even enables accurate calibration without requiring the purification of FPs. To obtain cellular protein concentrations, we consider methods for the conversion of optical density to either cell counts or alternatively to cell volumes, as well as examining how cells can interfere with protein counting via fluorescence quenching, which we quantify and correct for the first time. Calibration across different instruments, disparate filter sets and mismatched gains is demonstrated to yield equivalent results. It also reveals that mCherry absorption at 600nm does not confound cell density measurements unless expressed to over 100,000 proteins per cell. FPCountR is presented as pair of open access tools (protocol and R package) to enable the community to use this method, and ultimately to facilitate the quantitative characterisation of synthetic microbial circuits.