Forward genetic screens in model organisms are vital for identifying novel genes essential for developmental or disease processes. One drawback of these screens is the labor-intensive and sometimes inconclusive process of mapping the causative mutation. To leverage high-throughput techniques to improve this mapping process, we have developed a Mutation Mapping Analysis Pipeline for Pooled RNA-seq (MMAPPR) that works without parental strain information or requiring a preexisting SNP map of the organism, and adapts to differential recombination frequencies across the genome. MMAPPR accommodates the considerable amount of noise in RNA-seq data sets, calculates allelic frequency by Euclidean distance followed by Loess regression analysis, identifies the region where the mutation lies, and generates a list of putative coding region mutations in the linked genomic segment. MMAPPR can exploit RNA-seq data sets from isolated tissues or whole organisms that are used for gene expression and transcriptome analysis in novel mutants. We tested MMAPPR on two known mutant lines in zebrafish, nkx2.5 and tbx1, and used it to map two novel ENU-induced cardiovascular mutants, with mutations found in the ctr9 and cds2 genes. MMAPPR can be directly applied to other model organisms, such as Drosophila and Caenorhabditis elegans, that are amenable to both forward genetic screens and pooled RNA-seq experiments. Thus, MMAPPR is a rapid, cost-efficient, and highly automated pipeline, available to perform mutant mapping in any organism with a well-assembled genome.

Background: Genome editing techniques, including ZFN, TALEN, and CRISPR, have created a need to rapidly screen many F1 individuals to identify carriers of indels and determine the sequences of the mutations. Current techniques require multiple clones of the targeted region to be sequenced for each individual, which is inefficient when many individuals must be analyzed. Direct Sanger sequencing of a polymerase chain reaction (PCR) amplified region surrounding the target site is efficient, but Sanger sequencing genomes heterozygous for an indel results in a string of “double peaks” due to the mismatched region. Results: To facilitate indel identification, we developed an online tool called Poly Peak Parser (available at http://yost.genetics.utah.edu/software.php ) that is able to separate chromatogram data containing ambiguous base calls into wild‐type and mutant allele sequences. This tool allows the nature of the indel to be determined from a single sequencing run per individual performed directly on a PCR product spanning the targeted site, without cloning. Conclusions: The method and algorithm described here facilitate rapid identification and sequence characterization of heterozygous mutant carriers generated by genome editing. Although designed for screening F1 individuals, this tool can also be used to identify heterozygous indels in many contexts. Developmental Dynamics 243:1632–1636, 2014 . © 2014 The Authors. Developmental Dynamics published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of American Association of Anatomists

Abstract Seizures are generally associated with epilepsy but may also be a symptom of many other neurological conditions. A hallmark of a seizure is the intensity of the local neuronal activation, which can drive large-scale gene transcription changes. Such changes in the transcriptional profile are likely to alter neuronal function, thereby contributing to the pathological process. Therefore, there is a strong clinical imperative to characterie how gene expression is changed by seizure activity. To this end, we developed a simplified ex vivo technique for studying seizure-induced transcriptional changes. We compared the RNA sequencing profile in mouse neocortical tissue that had up to 3 hours of epileptiform activity induced by 4-aminopyridine (4AP), relative to control brain slices not exposed to the drug. We identified over 100 genes with significantly altered expression after 4AP treatment, including multiple genes involved in MAPK, TNF, and neuroinflammatory signalling pathways, all of which have been linked to epilepsy previously. Notably, the patterns in male and female brain slices were almost identical. Various immediate early genes were among those showing the largest upregulation. The set of down-regulated genes included ones that might be expected either to increase or to decrease neuronal excitability. In summary, we found the seizure-induced transcriptional profile to be complex, but the changes aligned well with an analysis of published epilepsy-associated genes. We discuss how simple models may provide new angles for investigating seizure-induced transcriptional changes. Significance Statement It is well-established that strong neuronal activation results in large-scale transcriptomic changes. Understanding this process is of particular importance in epilepsy, which is characterized by paroxysmal pathological discharges. The complexity of in vivo activity patterns, however, present many difficulties for interpretation of the transcriptional changes. In contrast, ex vivo seizure models provide better experimental control and quantification of activity patterns, with lower welfare impact. Importantly, we now show that these models also replicate the transcriptional patterns previously reported in chronic human and animal epilepsy, thus validating their use in these kinds of study.

SUMMARY The optic tectum (OT) is a multilaminated midbrain structure that acts as the primary retinorecipient in the zebrafish brain. Homologous to the mammalian superior colliculus, the OT is responsible for the reception and integration of stimuli, followed by elicitation of salient behavioral responses. While the OT has been the focus of functional experiments for decades, less is known concerning specific cell types, microcircuitry, and their individual functions within the OT. Recent efforts have contributed substantially to the knowledge of tectal cell types; however, a comprehensive cell catalog is incomplete. Here we contribute to this growing effort by applying single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) to characterize the transcriptomic profiles of tectal cells labeled by the transgenic enhancer trap line y304Et (cfos:Gal4;UAS:Kaede). We sequenced 13,320 cells, a 4X cellular coverage, and identified 25 putative OT cell populations. Within those cells, we identified several mature and developing neuronal populations, as well as non-neuronal cell types including oligodendrocytes, microglia, and radial glia. Although most mature neurons demonstrate GABAergic activity, several glutamatergic populations are present, as well as one glycinergic population. We also conducted Gene Ontology analysis to identify enriched biological processes, and computed RNA velocity to infer current and future transcriptional cell states. Finally, we conducted in situ hybridization to validate our bioinformatic analyses and spatially map select clusters. In conclusion, the larval zebrafish OT is a complex structure containing at least 25 transcriptionally distinct cell populations. To our knowledge, this is the first time scRNA-seq has been applied to explore the OT alone and in depth.

Transcription factor Nkx2.5 is frequently mutated in congenital heart disease, but the mechanisms by which Nkx2.5 regulates heart development are poorly understood. By generating comprehensive DNA methylome maps from zebrafish embryonic hearts in nxk2.5 mutants and siblings, we discovered that Nkx2.5 regulates DNA methylation patterns during cardiac morphogenesis. We identified hundreds of Nkx-dependent heart specific Differentially Methylated Regions (nhDMRs). A majority of the nhDMRs were hypomethylated in nkx2.5-/- hearts, correlating with changes in the mutant transcriptome, suggesting Nkx2.5 functions largely as a repressor. Distinct Nkx DNA-binding motifs were significantly enriched in subclasses of nhDMRs. Furthermore, nhDMRs were significantly associated with histone H3K4me1 and H3K27ac posttranslational modifications, suggesting Nkx2.5 regulates gene expression by differential methylation of cis-regulatory elements. Using transgenics, we validated several nhDMRs with enhancer activities in the heart. We propose a novel role of Nkx2.5 mediated DNA methylation is integral in activating and repressing Nkx2.5 target genes during heart development.

ABSTRACT CRISPR-Cas9 sgRNA libraries have transformed functional genetic screening and have enabled innovative CRISPR-based methods, such as the visualization of chromatin dynamics in living cells. These libraries have the potential to be applied to a vast number of biological systems and aid in the development of new technologies, but their synthesis is hindered by the cost, time requirements, and technical difficulty of current sgRNA library generation methods. Here, we describe SLALOM—a rapid enzymatic method for generating robust, variant-matched sgRNA libraries from any source of DNA in under 3 hours. This method utilizes a custom sgRNA scaffold sequence and a novel method for detaching oligonucleotides from solid supports using a strand displacing polymerase. Using this method, we have constructed libraries targeting the E. coli genome and the transcriptome of developing zebrafish hearts, demonstrating its potential to expand the reach of CRISPR technology and facilitate methods requiring custom sgRNA libraries.