Abstract It is technically challenging to study the content and properties of nanoscale bioparticles in a high-throughput and single-molecule manner. We developed a high-throughput analysis method, called single particle profiler (SPP) that provides single-particle information on content and biophysical properties of thousands of particles. We applied SPP to measure the mRNA encapsulation efficiency of lipid nanoparticles, viral binding efficiency of different nanobodies and biophysical heterogeneity of liposomes, lipoproteins, exosomes and viruses.

Abstract The assembly and dynamic reorganization of plasma membrane nanodomains (also known as “lipid rafts”) play key roles in host cell infection by human pathogens (e.g. viruses and bacteria). Viruses and bacteria can trigger the reorganization of lipid rafts which leads to membrane invaginations and downstream signaling that promote infection. Such reorganizations can be induced by interactions of bacterial or viral carbohydrate proteins (so-called lectins) with lipid raft glycosphingolipids (GSLs). Here, we studied the GSL globotriaosylceramide (Gb3) which is a key receptor involved in the cellular uptake of the gram-negative bacterium P. aeruginosa . The bacterial surface lectin LecA targets Gb3 and promotes bacterial invasion via the “lipid zipper” mechanism. However, the impact of LecA on the organization of membrane nanodomains is unknown yet. We mimicked of the plasma membrane using supported lipid bilayers (SLBs) that contained liquid-ordered (Lo, “raft-like”, enriched in sphingolipids and GSLs) and liquid-disordered (Ld, “non-raft-like” enriched in DOPC) lipid domains. Upon interaction with LecA, the Lo domains in the SLBs reshaped and dispersed. Moreover, deformation of SLBs was observed as LecA formed membrane multilayers on SLBs surface. We further dissected this process to reveal the impact of Gb3 structure, bilayer composition and LecA valence on the Lo reorganization.

Abstract Single particle profiler is a unique methodology to study nanoscale bioparticles such as liposomes, lipid nanoparticles, extracellular vesicles and lipoproteins in single particle and high throughput manner. The original version requires the single photon counting modules for data acquisition. Here, we present imaging-based SPP (iSPP) which can be performed by imaging a spot over time in common imaging mode with photomultiplier tubes. We also provide a user-friendly software with graphical user interface to facilitate the application of this technique. We demonstrate that iSPP can be used to decipher lipid-protein interactions, membrane modifications by drugs and the heterogeneity of extracellular vesicles isolated from cells lines and urine of human donors.

Class A G protein-coupled receptors (GPCRs), a superfamily of cell membrane signaling receptors, moonlight as constitutively active phospholipid scramblases. The plasma membrane of metazoan cells is replete with GPCRs, yet has a strong resting trans-bilayer phospholipid asymmetry, with the signaling lipid phosphatidylserine confined to the cytoplasmic leaflet. To account for the persistence of this lipid asymmetry in the presence of GPCR scramblases, we hypothesized that GPCR-mediated lipid scrambling is regulated by cholesterol, a major constituent of the plasma membrane. We now present a technique whereby synthetic vesicles reconstituted with GPCRs can be supplemented with cholesterol to a level similar to that of the plasma membrane and show that the scramblase activity of two prototypical GPCRs, opsin and the β1-adrenergic receptor, is impaired upon cholesterol loading. Our data suggest that cholesterol acts as a switch, inhibiting scrambling above a receptor-specific threshold concentration to disable GPCR scramblases at the plasma membrane.

ABSTRACT The dynamic behavior of plasma membrane proteins mediates various cellular processes such as cellular motility, communication, and signaling. It is widely accepted that the dynamics of the membrane proteins is determined either by the interactions of the transmembrane domain with the surrounding lipids or by the interactions of the intracellular domain with cytosolic components such as cortical actin. Although initiation of different cellular signaling events at the plasma membrane has been attributed to the extracellular domain (ECD) properties recently, the impact of ECDs on the dynamic behavior of membrane proteins is rather unexplored. Here, we investigate how the ECD properties influence protein dynamics in the lipid bilayer by reconstituting ECDs of different sizes or glycosylation in model membrane systems and analyzing ECD-driven protein sorting in lipid domains as well as protein mobility. Our data shows that increasing the ECD mass or glycosylation leads to a decrease in ordered domain partitioning and diffusivity. Our data reconciles different mechanisms proposed for the initiation of cellular signaling by linking the ECD size of membrane proteins with their localization and diffusion dynamics in the plasma membrane. SIGNIFICANCE STATEMENT We studied how the size and glycosylation of the proteins influences their dynamic behavior in a lipid bilayer by reconstituting the ECDs of different sizes or glycosylation in model membrane systems and analyzing their sorting into lipid domains as well as their mobility. We observe that increasing the ECD apparent mass leads to a decrease in membrane ordered domain partitioning and diffusivity. Our data reconciles multiple mechanisms proposed for the initiation of cellular signaling by linking the ECD properties of membrane proteins with their localization and diffusion dynamics in the plasma membrane.

Abstract Lipid transfer from lipoprotein particles to cells is essential for lipid homeostasis. High density lipoprotein (HDL) particles are mainly captured by cell-membrane-associated scavenger receptor class B type 1 (SR-B1) from the blood stream while low and very low density lipoprotein (LDL, VLDL) particles are mostly taken up by receptor-mediated endocytosis. However, the role of the target lipid membrane itself in the transfer process has been largely neglected so far. Here, we study how lipoprotein particles (HDL, LDL and VLDL) interact with synthetic lipid bilayers and cell-derived membranes and transfer their cargo subsequently. Employing cryo-electron microscopy, spectral imaging and fluorescence (cross) correlation spectroscopy allowed us to observe integration of all major types of lipoprotein particles into the membrane and delivery of their cargo in a receptor-independent manner. Importantly, biophysical properties of the target cell membranes change upon cargo delivery. The concept of receptor-independent interaction of lipoprotein particles with membranes helps to better understand lipoprotein particle biology and can be exploited for novel treatments of dyslipidemia diseases.

Extracellular vesicles (EVs) function as natural delivery vectors and mediators of biological signals across tissues. Here, by leveraging these functionalities, we show that EVs decorated with an antibody-binding moiety specific for the fragment crystallizable (Fc) domain can be used as a modular delivery system for targeted cancer therapy. The Fc-EVs can be decorated with different types of immunoglobulin G antibody and thus be targeted to virtually any tissue of interest. Following optimization of the engineered EVs by screening Fc-binding and EV-sorting moieties, we show the targeting of EVs to cancer cells displaying the human epidermal receptor 2 or the programmed-death ligand 1, as well as lower tumour burden and extended survival of mice with subcutaneous melanoma tumours when systemically injected with EVs displaying an antibody for the programmed-death ligand 1 and loaded with the chemotherapeutic doxorubicin. EVs with Fc-binding domains may be adapted to display other Fc-fused proteins, bispecific antibodies and antibody-drug conjugates.