Nuclear receptors transduce hormonal signals by binding directly to DNA target sites in promoters and modulating the transcription of linked genes. Receptor-mediated transactivation appears to be potentiated in response to ligand by a number of coactivators that may provide key interactions with components of the transcription preinitiation complex and/or alter chromatin structure. Here, we use the vitamin D 3 receptor ligand-binding domain (VDR LBD) as an affinity matrix to identify components of a transcriptionally active nuclear extract that interact with VDR in response to ligand. We describe the purification of a complex of at least 10 VDR interacting proteins (DRIPs) ranging from 65 to 250 kD that associate with the receptor in a strictly 1,25-dihydroxyvitamin D 3 -dependent manner. These proteins also appear to interact with other, but not all, nuclear receptors, such as the thyroid hormone receptor. The DRIPs are distinct from known nuclear receptor coactivators, although like these coactivators, their interaction also requires the AF-2 transactivation motif of VDR. In addition, the DRIP complex contains histone acetyltransferase activity, indicating that at least one or more of the DRIPs may function at the level of nucleosomal modification. However, we show that the DRIPs selectively enhance the transcriptional activity of VDR on a naked DNA template utilizing a cell-free, ligand-dependent transcription assay. Moreover, this activity can be specifically depleted from the extract by liganded, but not unliganded, VDR-LBD. Overexpression of DRIP100 in vivo resulted in a strong squelching of VDR transactivation, suggesting the sequestration of other limiting factors, including components of the DRIP complex. These results demonstrate the existence of a new complex of novel functional nuclear receptor coactivators.

Abstract Promoters and enhancers are sites of transcription initiation (TSSs) and carry active histone modifications, including H3K4me1, H3K4me3, and H3K27ac. Yet, the principles governing the boundaries of such regulatory elements are still poorly characterized. Alu elements are good candidates for a boundary function, being highly abundant in gene-rich regions, while essentially excluded from regulatory elements. Here, we show that the interval from the TSS to the first upstream Alu accommodates all H3K4me3 and most H3K27ac marks, while excluding DNA methylation. Remarkably, the average length of this intervals greatly varies in-between tissues, being longer in stem-and shorter in immune-cells. The very shortest TSS-to-Alu intervals were observed at promoters active in T cells, particularly at immune genes, correlating with RNA polymerase II transcription through the first Alu and accumulation of H3K4me1 signal on this first Alu. Finally, DNA methylation at first-Alus was found to evolved with age, regressing from young to middle-aged, then recovering later in life. Thus, the first Alus upstream of TSSs appear as dynamic boundaries marking the transition from DNA methylation to active histone modifications at regulatory elements, while also participating in the recording of immune gene transcriptional events by positioning H3K4me1-modified nucleosomes.

ABSTRACT HP1 proteins are best known as markers of heterochromatin and gene silencing. Yet, they are also RNA-binding proteins and the HP1γ/Cbx3 family member is present on transcribed genes together with RNA polymerase II, where it regulates co-transcriptional processes such as alternative splicing. To gain insight in the role of the RNA binding activity of HP1γ in transcriptionally active chromatin, we have captured and analyzed RNAs associated with this protein. We find that HP1γ specifically recognizes hexameric RNA motifs and coincidentally transposable elements of the SINE family. As these elements are abundant in introns, while essentially absent from exons, the HP1γ RNA binding activity tethers unspliced pre-mRNA to chromatin via the intronic region and limits the usage of intronic cryptic splice sites. Thus, our data unveil novel determinants in the relationship between chromatin and co-transcriptional splicing.

Accumulation of senescent cells is an important contributor to chronic inflammation upon aging. While cytoplasmic DNA was shown to drive the inflammatory phenotype of senescent cells, an equivalent role for RNA has never been explored. Here, we show that cellular senescence correlates with reduced expression of RNA exosome subunits and coincident accumulation of promoter RNAs and immature RNA transcripts. Forced accumulation of these RNAs by inactivation of the Exosc3 exosome subunit induces expression of senescence markers and reduced mitochondrial gene expression. Reciprocally, mitochondrial suffering and oxidative stress results in reduced RNA decay, suggestive of a feedback loop between RNA decay and mitochondrial activity. As several of the accumulating RNAs are also produced during normal activation of immune cells and contain Alu sequences known to trigger an innate immune response, we propose that stabilizing immature and unstable RNAs participate in driving and maintaining the permanent inflammatory state characteristic of cellular senescence.

HP1α/CBX5 is an epigenetic regulator with a suspected role in multiple sclerosis (MS). Here, using high-depth RNA sequencing on monocytes, we identified a subset of MS patients with reduced CBX5 expression, correlating with progressive stages of the disease and extensive transcriptomic alterations. Examination of rare non-coding RNA species in these patients revealed impaired maturation/degradation of U snRNAs and enhancer RNAs, indicative of reduced activity of the Integrator, a complex with suspected links to increased MS risk. At protein-coding genes, compromised Integrator activity manifested in reduced pre-mRNA splicing efficiency and altered expression of genes regulated by RNA polymerase II pause–release. Inactivation of Cbx5 in the mouse mirrored most of these transcriptional defects and resulted in hypersensitivity to experimental autoimmune encephalomyelitis. Collectively, our observations suggested a major contribution of the Integrator complex in safeguarding against transcriptional anomalies characteristic of MS, with HP1α/CBX5 emerging as an unexpected regulator of this complex’s activity. These findings bring novel insights into the transcriptional aspects of MS and provide potential new criteria for patient stratification.

Abstract While the role of the immune system in multiple sclerosis (MS) is widely acknowledged, our comprehension of the transcriptional foundations of this prevalent neurological disorder remains largely incomplete. Here, we conducted high-depth RNA sequencing on monocytes from a cohort of patients with MS to explore rare RNA species associated with the disease. In a subset of the patients, a markedly altered transcriptome was observed, coinciding with a decreased expression of the epigenetic silencer HP1α/CBX5. These patients also exhibited diminished expression of multiple genes encoding subunits of the Integrator complex. Alongside, there were clear indications of decreased Integrator activity, including impaired U snRNA and enhancer-RNA maturation/degradation and dysregulated RNA polymerase II (RNAPII) pause-release. Inactivation of Cbx5 in the mouse recapitulated the defects in Integrator activity and resulted in hypersensitivity to Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). While these data implied an unexpected function for HP1α in regulating RNAPII pause-release, they also showed that the dysregulation of numerous genes in MS patients could be adributed to either the biased distribution of transcription toward the 5’ end of genes or the heightened elongation and stability of enhancer RNAs. We therefore propose that impaired Integrator activity, which has been hinted at by mutations within Integrator subunits previously linked to an increased risk of MS, can provide a well-defined mechanistic understanding of the transcriptional anomalies associated with the disease.