Aneuploidy, whole chromosome or chromosome arm imbalance, is a near-universal characteristic of human cancers. In 10,522 cancer genomes from The Cancer Genome Atlas, aneuploidy was correlated with TP53 mutation, somatic mutation rate, and expression of proliferation genes. Aneuploidy was anti-correlated with expression of immune signaling genes, due to decreased leukocyte infiltrates in high-aneuploidy samples. Chromosome arm-level alterations show cancer-specific patterns, including loss of chromosome arm 3p in squamous cancers. We applied genome engineering to delete 3p in lung cells, causing decreased proliferation rescued in part by chromosome 3 duplication. This study defines genomic and phenotypic correlates of cancer aneuploidy and provides an experimental approach to study chromosome arm aneuploidy.

Summary

 DNA damage repair (DDR) pathways modulate cancer risk, progression, and therapeutic response. We systematically analyzed somatic alterations to provide a comprehensive view of DDR deficiency across 33 cancer types. Mutations with accompanying loss of heterozygosity were observed in over 1/3 of DDR genes, including TP53 and BRCA1/2. Other prevalent alterations included epigenetic silencing of the direct repair genes EXO5, MGMT, and ALKBH3 in ∼20% of samples. Homologous recombination deficiency (HRD) was present at varying frequency in many cancer types, most notably ovarian cancer. However, in contrast to ovarian cancer, HRD was associated with worse outcomes in several other cancers. Protein structure-based analyses allowed us to predict functional consequences of rare, recurrent DDR mutations. A new machine-learning-based classifier developed from gene expression data allowed us to identify alterations that phenocopy deleterious TP53 mutations. These frequent DDR gene alterations in many human cancers have functional consequences that may determine cancer progression and guide therapy.

Loss-of-function mutations affecting one or both copies of the Ten-Eleven-translocation (TET)2 gene have been described in various human myeloid malignancies. We report that inactivation of Tet2 in mouse perturbs both early and late steps of hematopoiesis including myeloid and lymphoid differentiation in a cell-autonomous manner, endows the cells with competitive advantage, and eventually leads to the development of malignancies. We subsequently observed TET2 mutations in human lymphoid disorders. TET2 mutations could be detected in immature progenitors endowed with myeloid colony-forming potential. Our results show that the mutations present in lymphoid tumor cells may occur at both early and later steps of lymphoid development and indicate that impairment of TET2 function or/and expression predisposes to the development of hematological malignancies.

Summary

 Comprehensive multiplatform analysis of 80 uveal melanomas (UM) identifies four molecularly distinct, clinically relevant subtypes: two associated with poor-prognosis monosomy 3 (M3) and two with better-prognosis disomy 3 (D3). We show that BAP1 loss follows M3 occurrence and correlates with a global DNA methylation state that is distinct from D3-UM. Poor-prognosis M3-UM divide into subsets with divergent genomic aberrations, transcriptional features, and clinical outcomes. We report change-of-function SRSF2 mutations. Within D3-UM, EIF1AX- and SRSF2/SF3B1-mutant tumors have distinct somatic copy number alterations and DNA methylation profiles, providing insight into the biology of these low- versus intermediate-risk clinical mutation subtypes.

We conducted the largest investigation of predisposition variants in cancer to date, discovering 853 pathogenic or likely pathogenic variants in 8% of 10,389 cases from 33 cancer types. Twenty-one genes showed single or cross-cancer associations, including novel associations of SDHA in melanoma and PALB2 in stomach adenocarcinoma. The 659 predisposition variants and 18 additional large deletions in tumor suppressors, including ATM, BRCA1, and NF1, showed low gene expression and frequent (43%) loss of heterozygosity or biallelic two-hit events. We also discovered 33 such variants in oncogenes, including missenses in MET, RET, and PTPN11 associated with high gene expression. We nominated 47 additional predisposition variants from prioritized VUSs supported by multiple evidences involving case-control frequency, loss of heterozygosity, expression effect, and co-localization with mutations and modified residues. Our integrative approach links rare predisposition variants to functional consequences, informing future guidelines of variant classification and germline genetic testing in cancer.

Abstract BRCA1 inactivation is a frequent event in basal-like breast carcinomas (BLC). However, BRCA1 can be inactivated by multiple mechanisms and determining its status is not a trivial issue. As an alternate approach, we profiled 65 BLC cases using single-nucleotide polymorphism arrays to define a signature of BRCA1-associated genomic instability. Large-scale state transitions (LST), defined as chromosomal break between adjacent regions of at least 10 Mb, were found to be a robust indicator of BRCA1 status in this setting. Two major ploidy-specific cutoffs in LST distributions were sufficient to distinguish highly rearranged BLCs with 85% of proven BRCA1-inactivated cases from less rearranged BLCs devoid of proven BRCA1-inactivated cases. The genomic signature we defined was validated in a second independent series of 55 primary BLC cases and 17 BLC-derived tumor cell lines. High numbers of LSTs resembling BRCA1-inactivated BLC were observed in 4 primary BLC cases and 2 BLC cell lines that harbored BRCA2 mutations. Overall, the genomic signature we defined predicted BRCA1/2 inactivation in BLCs with 100% sensitivity and 90% specificity (97% accuracy). This assay may ease the challenge of selecting patients for genetic testing or recruitment to clinical trials of novel emerging therapies that target DNA repair deficiencies in cancer. Cancer Res; 72(21); 5454–62. ©2012 AACR.

We analyzed molecular data on 2,579 tumors from The Cancer Genome Atlas (TCGA) of four gynecological types plus breast. Our aims were to identify shared and unique molecular features, clinically significant subtypes, and potential therapeutic targets. We found 61 somatic copy-number alterations (SCNAs) and 46 significantly mutated genes (SMGs). Eleven SCNAs and 11 SMGs had not been identified in previous TCGA studies of the individual tumor types. We found functionally significant estrogen receptor-regulated long non-coding RNAs (lncRNAs) and gene/lncRNA interaction networks. Pathway analysis identified subtypes with high leukocyte infiltration, raising potential implications for immunotherapy. Using 16 key molecular features, we identified five prognostic subtypes and developed a decision tree that classified patients into the subtypes based on just six features that are assessable in clinical laboratories.

Abstract Uveal melanoma, the most common eye malignancy, causes severe visual morbidity and is fatal in approximately 50% of patients. Primary uveal melanoma can be cured by surgery or radiotherapy, but the metastatic disease is treatment refractory. To understand comprehensively uveal melanoma genetics, we conducted single-nucleotide polymorphism arrays and whole-genome sequencing on 12 primary uveal melanomas. We observed only approximately 2,000 predicted somatic single-nucleotide variants per tumor and low levels of aneuploidy. We did not observe an ultraviolet radiation DNA damage signature, but identified SF3B1 mutations in three samples and a further 15 mutations in an extension cohort of 105 samples. SF3B1 mutations were associated with good prognosis and were rarely coincident with BAP1 mutations. SF3B1 encodes a component of the spliceosome, and RNA sequencing revealed that SF3B1 mutations were associated with differential alternative splicing of protein coding genes, including ABCC5 and UQCC, and of the long noncoding RNA CRNDE. Significance: Our data show that despite its dismal prognosis, uveal melanoma is a relatively simple genetic disease characterized by recurrent chromosomal losses and gains and a low mutational burden. We show that SF3B1 is recurrently mutated in uveal melanoma, and the mutations are associated with aberrant alternative splicing. Cancer Discov; 3(10); 1122–9. ©2013 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 1083

Hotspot mutations in the spliceosome gene SF3B1 are reported in ∼20% of uveal melanomas. SF3B1 is involved in 3'-splice site (3'ss) recognition during RNA splicing; however, the molecular mechanisms of its mutation have remained unclear. Here we show, using RNA-Seq analyses of uveal melanoma, that the SF3B1(R625/K666) mutation results in deregulated splicing at a subset of junctions, mostly by the use of alternative 3'ss. Modelling the differential junctions in SF3B1(WT) and SF3B1(R625/K666) cell lines demonstrates that the deregulated splice pattern strictly depends on SF3B1 status and on the 3'ss-sequence context. SF3B1(WT) knockdown or overexpression do not reproduce the SF3B1(R625/K666) splice pattern, qualifying SF3B1(R625/K666) as change-of-function mutants. Mutagenesis of predicted branchpoints reveals that the SF3B1(R625/K666)-promoted splice pattern is a direct result of alternative branchpoint usage. Altogether, this study provides a better understanding of the mechanisms underlying splicing alterations induced by mutant SF3B1 in cancer, and reveals a role for alternative branchpoints in disease.

Research Article17 June 2010Open Access Oxidative stress promotes myofibroblast differentiation and tumour spreading Aurore Toullec Aurore Toullec Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Damien Gerald Damien Gerald Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France These authors contributed equally to this study. Search for more papers by this author Gilles Despouy Gilles Despouy Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France These authors contributed equally to this study. Search for more papers by this author Brigitte Bourachot Brigitte Bourachot Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Melissa Cardon Melissa Cardon Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Sylvain Lefort Sylvain Lefort Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Marion Richardson Marion Richardson Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France Search for more papers by this author Guillem Rigaill Guillem Rigaill Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France Search for more papers by this author Maria-Carla Parrini Maria-Carla Parrini Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Carlo Lucchesi Carlo Lucchesi Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Dorine Bellanger Dorine Bellanger Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Marc-Henri Stern Marc-Henri Stern Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Thierry Dubois Thierry Dubois Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France Search for more papers by this author Xavier Sastre-Garau Xavier Sastre-Garau Institut Curie, Service de Pathologie, Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Olivier Delattre Olivier Delattre Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Anne Vincent-Salomon Anne Vincent-Salomon Institut Curie, Service de Pathologie, Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Fatima Mechta-Grigoriou Corresponding Author Fatima Mechta-Grigoriou [email protected] Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Aurore Toullec Aurore Toullec Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Damien Gerald Damien Gerald Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France These authors contributed equally to this study. Search for more papers by this author Gilles Despouy Gilles Despouy Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France These authors contributed equally to this study. Search for more papers by this author Brigitte Bourachot Brigitte Bourachot Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Melissa Cardon Melissa Cardon Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Sylvain Lefort Sylvain Lefort Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Marion Richardson Marion Richardson Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France Search for more papers by this author Guillem Rigaill Guillem Rigaill Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France Search for more papers by this author Maria-Carla Parrini Maria-Carla Parrini Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Carlo Lucchesi Carlo Lucchesi Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Dorine Bellanger Dorine Bellanger Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Marc-Henri Stern Marc-Henri Stern Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Thierry Dubois Thierry Dubois Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France Search for more papers by this author Xavier Sastre-Garau Xavier Sastre-Garau Institut Curie, Service de Pathologie, Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Olivier Delattre Olivier Delattre Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France Search for more papers by this author Anne Vincent-Salomon Anne Vincent-Salomon Institut Curie, Service de Pathologie, Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Fatima Mechta-Grigoriou Corresponding Author Fatima Mechta-Grigoriou [email protected] Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France Search for more papers by this author Author Information Aurore Toullec1, Damien Gerald1, Gilles Despouy1, Brigitte Bourachot1, Melissa Cardon1, Sylvain Lefort1, Marion Richardson2, Guillem Rigaill2, Maria-Carla Parrini1,3, Carlo Lucchesi1,3, Dorine Bellanger3, Marc-Henri Stern3, Thierry Dubois2, Xavier Sastre-Garau4, Olivier Delattre3, Anne Vincent-Salomon4 and Fatima Mechta-Grigoriou *,1 1Laboratory of strem and cancer, Inserm U830, Institut Curie, 75248 Paris, Cedex, France 2Institut Curie, Département de Transfert, Laboratoire de signalisation, Paris, France 3Inserm, Génétique et Biologie des cancers, Paris, France 4Institut Curie, Service de Pathologie, Paris, Cedex, France *Tel: +33-1-56-24-66-53; Fax: +33-1-56-24-66-50 EMBO Mol Med (2010)2:211-230https://doi.org/10.1002/emmm.201000073 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract JunD regulates genes involved in antioxidant defence. We took advantage of the chronic oxidative stress resulting from junD deletion to examine the role of reactive oxygen species (ROS) in tumour development. In a model of mammary carcinogenesis, junD inactivation increased tumour incidence and revealed an associated reactive stroma. junD-inactivation in the stroma was sufficient to shorten tumour-free survival rate and enhance metastatic spread. ROS promoted conversion of fibroblasts into highly migrating myofibroblasts through accumulation of the hypoxia-inducible factor (HIF)-1α transcription factor and the CXCL12 chemokine. Accordingly, treatment with an antioxidant reduced the levels of HIF and CXCL12 and numerous myofibroblast features. CXCL12 accumulated in the stroma of HER2-human breast adenocarcinomas. Moreover, HER2 tumours exhibited a high proportion of myofibroblasts, which was significantly correlated to nodal metastases. Interestingly, this subset of tumours exhibited a significant nuclear exclusion of JunD and revealed an associated oxido-reduction signature, further demonstrating the relevance of our findings in human cancers. Collectively, our data uncover a new mechanism by which oxidative stress increases the migratory properties of stromal fibroblasts, which in turn potentiate tumour dissemination. THE PAPER EXPLAINED PROBLEM: While the tumour microenvironment is known to contribute to tumour progression, the role of carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) remains controversial and their origin unclear. This study addresses the hypothesis that chronic oxidative stress can modulate tumour growth and spread by modulating surrounding tumour fibroblasts. RESULTS: We took advantage of the chronic oxidative stress resulting from junD deletion to examine the role of reactive oxygen species (ROS) in tumour development. In this model, CAFs derive from stress-exposed fibroblasts and promote metastatic dissemination of neoplastic cells. Pro-invasive myofibroblast properties resulted from ROS-mediated accumulation of the pro-angiogenic HIF-1α and the pro-inflammatory chemokine CXCL12 that activated the RhoA-GTPase. Invasive HER2-human breast adenocarcinomas, characterized by high rate of lymph node metastases, exhibit a correlated stromal accumulation of both CXCL12 and myofibroblasts and display an associated oxido-reduction signature, indicating the relevance of our findings in human cancers. IMPACT: HER2-amplifying human breast adenocarcinomas, a breast cancer molecular subtype associated with a very poor prognosis and lymph node metastases, express high levels of CXCL12 in the stroma. Our study raises the intriguing possibility that, in addition to current treatments, CXCR4-blocking antibodies may be effective in combating tumour metastasis in lymph node-positive HER2 patients. INTRODUCTION Carcinomas are highly complex tissues composed of neoplastic and stromal cells, including mesenchymal cells, fibroblasts or myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and inflammatory cells (Bissell & Radisky, 2001; Mueller & Fusenig, 2004). In past decades, the major focus of cancer research has been the transformed cell itself. However, new clinical data have shown that the stroma contributes significantly to the development of a wide variety of tumours. Tissues exhibiting chronically inflamed stroma or those suffering from repetitive wound healings display a higher incidence of tumour formation (Joyce & Pollard, 2009; Tlsty & Coussens, 2006). Fibroblasts are the most common type of stromal cells in various human carcinomas, yet their specific contributions to tumour growth have only recently been clarified (Erez et al, 2010; Orimo et al, 2005). Stromal fibroblasts, named carcinoma-associated fibroblasts (CAFs), have been extracted from a number of invasive human breast carcinomas. CAFs are more competent in promoting growth of mammary carcinoma cells and enhancing tumour angiogenesis than fibroblasts derived from outside tumour masses (Olumi et al, 1999; Orimo et al, 2005). CAFs also mediate tumour-enhancing inflammation (Erez et al, 2010). CAFs isolated from the stroma of invasive human breast cancers include large populations of myofibroblasts (Eyden et al, 2009). Myofibroblasts are often referred to as activated fibroblasts that play key roles in wound repair (Hinz et al, 2007). The myofibroblastic properties of CAFs are believed to increase tumour growth and enhance vascular remodelling. Myofibroblasts are characterized by high de novo expression of smooth muscle α-actin (SM-α-actin), the actin isoform typically found in vascular smooth muscle cells, and possess greatly enhanced contractile ability. Recent work has shown that CAFs secrete elevated levels of CXCL12, also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) (Orimo et al, 2005). CXCL12 is a homeostatic chemokine that mediates homing of stem cells to bone marrow by binding to its receptor (CXCR4) on circulating cells (Rossi & Zlotnik, 2000). CXCL12 not only stimulates carcinoma cell growth but also helps in recruiting endothelial progenitor cells to tumours, thereby furthering neo-angiogenesis (Orimo et al, 2005). The importance of this CXCL12–CXCR4 signalling pathway in the tumour microenvironment has already been addressed but, to our knowledge, its role in CAFs remains unexplored. The AP-1 (activator protein-1) transcription factor plays a critical role in regulating environmental stress responses (Mechta-Grigoriou et al, 2001). Recently, we discovered a new function of JunD, a member of the AP-1 family, in controlling oxidative stress and angiogenic switch (Gerald et al, 2004; Laurent et al, 2008). JunD protects cells against oxidative stress by regulating genes involved in antioxidant defence and H2O2 production. Subsequently, inactivation of junD leads to a persistent accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cells and tissues. Thus, junD-deficient mice and junD−/− derived-fibroblasts constitute good models for investigating the physiological consequences of chronic oxidative stress. Using these systems, we uncovered a molecular mechanism linking oxidative stress to angiogenesis and ageing (Gerald et al, 2004; Laurent et al, 2008). Accumulation of H2O2 reduces the activity of hypoxia-inducible factor (HIF)-prolyl-hydroxylases (PHDs), which signal HIF-α subunits for proteosomal degradation. In consequence, HIF-α proteins accumulate and enhance transcription of specific target genes such as VEGF-A (Pouyssegur & Mechta-Grigoriou, 2006). In this paper, we take advantage of the persistent oxidative stress due to junD inactivation to examine the role of ROS in tumour development. In a model of ras-mediated mammary carcinogenesis, junD deletion increases tumour growth and revealed extensively modified stroma. Moreover, dissemination of junD+/+ neoplastic cells was enhanced when grafted into junD−/− mice. Since JunD expression is detected in stromal fibroblasts, these data suggest that inactivation of junD in these cells, and consecutive oxidative stress, may affect the fibroblastic properties and potentiate tumour spread. Using junD-deficient fibroblasts, we demonstrated that oxidative stress promotes conversion of fibroblasts into myofibroblasts in an HIF-1α and CXCL12-dependent pathway. Conversely, long-term antioxidant treatment partially reverses myofibroblast differentiation. In agreement with our observations on mice, HER2-amplified tumours exhibit the highest expression levels of CXCL12 in the stroma and the highest correlated proportion of myofibroblasts, when compared to aggressive basal-like breast cancers (BLC) or to good prognosis luminal-A (Lum-A) breast carcinomas. Interestingly, HER2-subtype of tumours display a molecular signature characteristic of stress–response and a nuclear exclusion of the JunD protein. Since breast tumours which overexpress HER2 exhibit one of the poorest prognosis of all molecular classes of breast carcinomas and show a high rate of axillary lymph node metastases (Bartlett et al, 2007), these observations underline the role of oxidative stress and myofibroblasts in cancer metastases. RESULTS junD inactivation results in a reactive stroma and promotes tumour metastasis We have previously shown that inactivation of the junD gene leads to constitutive oxidative stress (Gerald et al, 2004; Laurent et al, 2008). To further investigate the role of such stress in tumour development, we crossed junD−/− mice with an MMTV-v-Ha-ras transgenic strain; a model for breast cancer (Sinn et al, 1987). Tumour-free survival rates were significantly lower in junD-deficient females compared to ras junD+/+ (referred to as ras) ones (Fig 1A). Moreover, the number and volume of tumours were higher in ras junD−/− mice compared to control animals (Fig 1B and C). To better understand the underlying mechanism, we compared histological properties of ras junD−/− and ras tumours when they reached the same size (Fig 1D; Fig S1). Inactivation of junD generally affected characteristics of the tumours, as well as features of the associated stroma. When compared to ras tumours (Fig 1Da,c; Fig S1Aa), deletion of junD in ras-mediated tumours resulted in an increased proportion of polycystic carcinomas (Fig 1Db; Fig S1Ac) and massive fibrosis (Fig 1Dd), indicated by the accumulation of various forms of collagen. Moreover, the number and the size of blood vessels increased in ras junD−/− tumours compared to ras (Fig 1De,f), confirming our previous results that junD deletion increased angiogenesis in vivo (Gerald et al, 2004; Laurent et al, 2008). We quantified each cell type composing the tumours by specific immunohistochemistry staining. Epithelial cells, fibroblasts, myofibroblasts, macrophages and haematopoietic cells were specifically stained using E-cadherin, vimentin, SM-α-actin, F4/80 and CD45-specific antibodies, respectively (Fig 1D and E; Fig S1B). In both genotypes, epithelial cells remained highly differentiated, as evaluated by expression of E-cadherin at cellular surface (Fig 1Dg,h; Fig S1B), further indicating that junD inactivation did not promote massive epithelial to mesenchymal transition (EMT). In contrast, the tumour surrounding stroma was quantitatively and qualitatively modified by junD deletion. The proportion of CAF was significantly higher in ras junD−/− tumours compared to ras ones (Fig 1Di,j and E; Fig S1B). Moreover, ras junD−/− fibroblasts expressed higher levels of vimentin, a type III intermediate filament, than controls (Fig 1Di,j; Fig S1B) and accumulated podoplanin, a glycoprotein characteristic of reactive stroma (Fig 1Dm,n). Furthermore, ras junD−/− tumours exhibited significant increase in myofibroblasts content, evaluated by the number of SM-α-actin-positive fibroblasts (Fig 1Do,p). Finally, the stroma of ras junD−/− tumours overproduced the CXCL12 chemokine (Fig 1Dq,r; Fig S1D) and exhibited increased recruitment of inflammatory cells (Fig 1Dk,l). Staining with specific markers for macrophages (Fig 1Ds,t and E) and haematopoietic cells (data not shown) indicated that both cell types were recruited more efficiently in ras junD−/− tumours compared to ras. All these observations reveal highly vascularized tumours with reactive stroma in junD-deficient ras-mediated tumours, features that are not seen in ras tumours alone strongly arguing that JunD is involved in these processes. Figure 1. junD inactivation promotes appearance of a reactive stroma and tumour progression. A.. Kaplan–Meyer tumour-free survival curve of ras junD+/+ (referred to as ras) animals (n = 12) and ras junD−/−mice (n = 12) (p = 0.0092, log-rank test). B.. Number of tumours per animal in ras (n = 12) and ras junD−/− (n = 12) mice. C.. Tumour volumes in ras (n = 10) and ras junD−/− (n = 9) mice. D.. Sections and histological analysis of epithelial tumours (a–h) and immediate adjacent stroma (i–t) from ras or ras junD−/− animals. Sections have been coloured with HES (haematoxylin-eosin-saffranin) (a,b,k,l), Masson's trichrome (c,d) or immunostained with specific antibodies, as indicated (e–j,m–t). E.. Percentage of epithelial and fibroblastic compartments in the tumours has been evaluated using E-cadherin and Vimentin-specific staining, respectively. Are also indicated intensity (Int), percentage of positive cells (%) and H scoring (Int × %) for E-cadherin, Vimentin and SM-α-actin-staining as well as the number of F4/80- or CD45-positive cells per µm2. n represents the number of animals analysed per genotype; n represents the number of tumours analysed per genotype. Data are means ± SEM. *p < 0.05 by student's test. Scale bars = 20 µm in (Da,b,k,l) and 40 µm in (Dc–j,Dm–t). Download figure Download PowerPoint To further define the function of JunD, we monitored its pattern of expression in ras-derived tumours. JunD expression was detected in neoplastic epithelial cells (Fig S1Ca,e) and in stromal fibroblasts (Fig S1Cb,f), suggesting that its deletion can directly impact both compartments. In order to explore the role of JunD only in stromal fibroblasts, we performed transplant experiments by injecting B16F10, a transformed cell line of the same immunotype as our immunocompetent wt and junD−/− mice. Resulting tumours developed in either a wt or a junD−/− host. Although junD-deficient mice showed earlier tumour onset than wt animals (Fig 2A), both types of tumours reached the same mean volume (data not shown) and did not display obvious accumulation of inflammatory cells (Fig S1E). In contrast, tumours developed in junD-deficient environment accumulated significantly both SM-α-actin and CXCL-12 (Fig 2B and C). In addition, stromal inactivation of junD notably increased the incidence and size of metastases in lungs (Fig 2D and E). To confirm the role of CXCL12 in junD-mediated tumourigenesis, we have treated daily grafted junD−/− mice by specific CXCL12 siRNA (Fig 2F). Interestingly, silencing of CXCL12 decreased significantly tumour size and prevented lung metastases. Taken together, these results indicate that inactivation of junD in the tumour environment is sufficient to modify tumour properties, increase the content in SM-α-actin-expressing cells and promote tumour growth and spread, in a CXCL12-dependent manner. Figure 2. junD inactivation in the stroma potentiates tumour metastasis. A.. Kaplan–Meyer tumour-free survival curve of wt (n = 10) and junD−/− mice (n = 10) in graft experiments using B16F10 cells (p = 0.041, log-rank test). B,C. Representative immunohistochemistry of tumours from injected wt (a,c) and junD−/− mice (b,d) using SM-α-actin and CXCL12-specific antibodies. D.. Typical HES views of lungs from injected mice. Sections show large (b) and medium (d) sizes of metastatic nodules in junD−/− mice compared to wt animals (a,c). E.. Number of total, small-sized (<10 cells), medium-sized (10 cells < × < 50 cells) and large-sized (>50 cells) metastasis in wt and junD−/− mice. Numbers below indicate the percentage of large-, medium- and small-sized metastasis in the respective populations. F.. Tumour volumes in junD−/− mice treated daily either with control siRNA (black) or with specific CXCL12-directed siRNA. Data are means ± SEM. *p < 0.05 and ***p < 0.005 by student's test. N represents the number of tumours analysed per genotype. Scale bars = 40 µm. Download figure Download PowerPoint junD-deficient fibroblasts exhibit features of CAFs Since junD expression has been detected in tumour-associated fibroblasts, we next investigated whether inactivation of junD, followed by oxidative stress, was sufficient to alter the properties of fibroblasts. We investigated the gene expression profile and morphology of immortalized junD−/− fibroblasts in a tumour-free context and compared them with the already reported characteristics of CAFs (Fig 3). We first identified a subset of 1934 genes that were significantly up-regulated (p < 0.05) in junD-deficient fibroblasts compared to wt cells. We next compared this list (referred to as junD−/−) with two partially overlapping lists of CAF-specific genes (Allinen et al, 2004; Farmer et al, 2009), set of genes that is also up-regulated in desmoid-type fibromatosis, further underscoring their tumour-associated fibroblastic molecular signature (West et al, 2005) (Fig 3A). The Allinen' and Farmer's lists were composed of 201 and 161 genes, respectively. Among these genes, 44 from Allinen's list and 17 from Farmer's were up-regulated in junD−/− versus wt fibroblasts (Table S1). This is significantly more than would be expected by chance (namely, p = 10−20 for Allinen versus junD−/− and p = 10−4 for Farmer versus junD−/−, using Fisher Exact test). Genes encoding extracellular matrix proteins (including collagens I, III, IV, fibronectin, sparc), components of the cytoskeleton (myosin) and matrix metalloproteases (MMP2, MMP14) were up-regulated in the three lists (Fig 3A). These data argue that expression profiles of junD−/− fibroblasts are related to the expression signature of CAFs. junD inactivation is thus sufficient to confer CAF properties, even in a tumour-free context. Figure 3. junD−/− fibroblasts exhibit features of carcinoma-associated myofibroblasts. A.. Venn's diagram showing the number of common up-regulated genes in CAF (from Allinen's and Farmer's studies) and junD−/− fibroblasts. On the right panel, the 14 genes common to the three lists are listed. B.. Representative immunofluorescence staining from wt and junD−/− cells using specific antibodies, as indicated. Arrows indicate typical staining. Inserted section in (f) shows a higher magnification (100×) image of a representative AJ co-stained with SM-α-actin (in green) and N-cadherin (in red). C.. Western blots of whole cell extracts from wt and junD−/− fibroblasts. Ponceau colouration was used as an internal control for each protein loading; a representative gel is shown. D.. Migration assay of wt compare with junD−/− fibroblasts. *p < 0.05 by student test. Scale bars = 10 µm (Ba–d,g–l) and 5 µm in (Be,f). Download figure Download PowerPoint Since CAFs contain a high proportion of myofibroblasts, we analysed whether junD deletion caused fibroblasts to adopt myofibroblastic features. Compared to wt cells, junD−/− fibroblasts exhibited significant accumulation of SM-α-actin (Fig 3Ba,b), increased assembly of F-actin containing stress fibres (Fig 3Bc,d) and recruitment of SM-α-actin into those stress fibres (Fig S2A). Moreover, just as in differentiated myofibroblasts, junD−/− fibroblasts differed from wt cells in having a significantly higher number of adherens junctions (AJ) (Fig 3Be,f) and an enhanced assembly of mature focal adhesions (FA), characterized by an increase in vinculin, tensin and focal adhesion kinase (FAK) content (Fig 3Bg-l, Fig S2B for quantitative analyses). SM-α-actin protein (Fig 3C) and mRNA (Fig S2C) were increased in junD−/− cells compared to wt. In contrast, total amounts of all other tested proteins remained similar between the two cell types (Fig 3C), further suggesting that inactivation of junD modulated the polymerization of F-actin, the recruitment of N-cadherin to AJ and the association of vinculin or tensin to FA but had only a marginal effect on their total levels. Finally, cellular migration assessed by transwell assays was increased in junD−/− fibroblasts as compared to wt cells (Fig 3D). Hence, these data show that inactivation of junD in fibroblasts converts them into myofibroblasts and increases their cellular migration potential. CXCL12 plays a key role in acquisition of myofibroblast properties Since expression of SM-α-actin in myofibroblasts is coordinately regulated by transforming growth factor β1 (TGF-β1) (Hinz et al, 2007; Ronnov-Jessen et al, 1995), we analysed the role of TGF-β1 in acquisition of junD−/− myofibroblast properties. Treatment of junD−/− cells with an inhibitory drug targeting the TGF-β1 pathway did not alter their myofibroblast properties (such as accumulation of SM-α-actin containing stress fibres), despite clearly decreasing phosphorylation of key TGF-β effector Smad3 (Fig S2D). These observations indicate that the myofibroblast properties of junD−/− cells do not result from activation of the TGF-β pathway and strongly suggest that JunD regulates another process, which contributes to the phenotype. wt fibroblasts incubated with conditioned medium from junD−/− cells exhibited accumulation of SM-α-actin containing stress fibres (Fig 4A), further arguing for the role of a secreted factor. The expression of the chemokine CXCL12 was increased in junD−/− fibroblasts (Fig S2E). Since we observed that junD-dependent CXCL12 accumulation in the stroma was critical for tumour growth and spread, we next investigated if the myofibroblastic phenotype detected in junD-deficient cells may be dependent upon CXCL12. Addition of exogenous CXCL12 into the culture medium of wt cells was sufficient to increase the proportion of SM-α-actin containing stress fibres (Fig 4B). Conversely, silencing of CXCL12 decreased the level of SM-α-actin, the formation of stress fibres, the number of AJ and the proportion of mature FA in junD−/− cells, while the control siRNA had no effect (Fig 4C; Fig S2F). To further validate the CXCL12-dependent autocrine loop in fibroblasts, we confirmed that the CXCR4 receptor was expressed in fibroblasts and detected at the cellular surface (Fig S2G). Moreover, as expected from elevated CXCR4 activity, junD-deficient fibroblasts accumulated phosphorylated forms of ERK1/2, a typical response elicited by this G-protein coupled receptor (Fig 4D). Because small Guanosine triphosphate (GTP)-binding proteins of the Rho family play a central role in regulation of the actin-based cytoskeleton and cell movement, we looked at their activation status by pull-down assays (Fig 4E). Although RhoA and Rac protein levels were comparable between wt and junD−/− fibroblasts (input, Fig 4E and data not shown), junD-deficient cells exhibited higher levels of the GTP-bound form of RhoA as compared to wt fibroblasts (Fig 4E, left part). However, in parallel experiments, we did not detect accumulation of GTP-Rac in junD−/− cells (Fig 4E, right part). Furthermore, treatment of junD−/− fibroblasts with exoenzyme C3 transferase (CT03), a drug that inhibits RhoA Guanosine diphosphate (GDP)/GTP exchange activity, severely affected SM-α-actin polymerization, the formation of F-actin containing stress fibres, the number of AJ and the assembly of FA (Fig 4F). Taken as a whole, these data strongly suggest that the CXCL12/CXCR4 pathway activates the RhoA-GTPase and in turn promotes myofibroblastic properties. Figure 4. CXCL12 is necessary and sufficient for promoting myofibroblast properties. A.. SM-α-actin staining in wt fibroblasts after incubation in wt or junD−/−-conditioned medium. At the bottom is the corresponding Western blot. B.. SM-α-actin staining in wt fibroblasts after addition of exogenous CXCL12 protein. At the bottom is the corresponding Western blot. C.. Representative immunofluorescence of myofibroblast markers in junD−/− fibroblasts