The ERG1A K+ channel modulates the protein degradation that contributes to skeletal muscle atrophy by increasing intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) and enhancing calpain activity, but the mechanism by which the channel regulates the [Ca2+]i is not known. Here, we have investigated the effect of human ERG1A (HERG) on [Ca2+]i in C2C12 myotubes, using fura-2 calcium assays, immunoblot, RT-qPCR, and electrophysiology. We hypothesized that HERG would modulate L-type calcium channel activity, specifically the Cav1.1 channel known to carry signal from the sarcoplasmic membrane of skeletal muscle to the sarcomeres of the myofibrils. However, we find that HERG has no effect on the amplitude of L-type channel current nor does it affect the mRNA levels nor protein abundance of the Cav1.1 channel. Instead we find that, although the rise in [Ca2+]i (induced by depolarization) is greater in myotubes over-expressing HERG relative to controls, it is not sensitive to the L-type channel blocker nifedipine, which suggests that HERG modulates excitation coupled calcium entry (ECCE). Indeed, the HERG-enhanced increase in [Ca2+]i induced by depolarization is blocked by 2-APB, an inhibitor of ECCE. Further we discovered that HERG also modulates store operated calcium entry and the activity of ryanodine receptors. Therefore, we decided to investigate the effect of HERG on calsequestrin 1, a calcium buffering/binding protein known to modulate ryanodine receptor 1 and store operated Ca2+ entry activities. Indeed, we find that calsequestrin 1 mRNA levels are decreased by 17% (p<0.05) and the total protein abundance is lowered 77% (p<0.05) in myotubes over-expressing HERG relative to controls. In summary, the data show that ERG1A overexpression modulates [Ca2+]i in skeletal muscle cells by lowering the abundance of the calcium buffering/binding protein calsequestrin 1.

Abstract The ER Ca 2+ channel ryanodine receptor 2 (RyR2) is required for maintenance of insulin content and glucose-stimulated insulin secretion, in part, via regulation of the protein IRBIT in the insulinoma cell line INS-1. Here, we examined store-operated and depolarization-dependent Ca 2+ entry using INS-1 cells in which either RyR2 or IRBIT were deleted. Store-operated Ca 2+ entry (SOCE) stimulated with thapsigargin was reduced in RyR2 KO cells compared to controls, but was unchanged in IRBIT KO cells. STIM1 protein levels were not different between the three cell lines. Basal and stimulated (500 μM carbachol) phospholipase C (PLC) activity was also reduced specifically in RyR2 KO cells. Insulin secretion stimulated by tolbutamide was reduced in RyR2 KO and IRBIT KO cells compared to controls, but was potentiated by an EPAC-selective cAMP analog in all three cell lines. Cellular PIP 2 levels were increased and cortical f-actin levels were reduced in RyR2 KO cells compared to controls. Whole-cell Ca v channel current density was increased by 65% in RyR2 KO cells compared to controls, and barium current was reduced by acute activation of the lipid phosphatase pseudojanin preferentially in RyR2 KO cells over control INS-1 cells. Action potentials stimulated by 18 mM glucose were more frequent in RyR2 KO cells compared to controls, and insensitive to the SK channel inhibitor apamin. Taken together, these results suggest that RyR2 plays a critical role in regulating PLC activity and PIP 2 levels via regulation of SOCE. RyR2 also regulates β-cell electrical activity by controlling Ca v current density, via regulation of PIP 2 levels, and SK channel activation.

Abstract The role of ER Ca 2+ release via ryanodine receptors (RyR) in pancreatic β-cell function is not well defined. Deletion of RyR2 from the rat insulinoma INS-1 (RyR2 KO ) enhanced the Ca 2+ integral (AUC) stimulated by 7.5 mM glucose, and rendered it sensitive to block by the IP 3 receptor inhibitor xestospongin C, coincident with reduced levels of the protein IP 3 R eceptor B inding protein released with Inositol 1,4,5 T risphosphate (IRBIT; aka AHCYL1). Deletion of IRBIT from INS-1 cells (IRBIT KO ) increased the Ca 2+ AUC in response to 7.5 mM glucose and induced xestospongin sensitivity. Insulin content and basal (2.5 mM glucose) and 7.5 mM glucose-stimulated insulin secretion were reduced in RyR2 KO cells and more modestly reduced in IRBIT KO cells compared to controls. INS2 mRNA levels were reduced in both RyR2 KO and IRBIT KO cells, but INS1 mRNA levels were specifically decreased in RyR2 KO cells. Nuclear localization of S-adenosylhomocysteinase (AHCY) was increased in RyR2 KO and IRBIT KO cells. DNA methylation of the INS1 and INS2 gene promotor regions was very low, and not different among RyR2 KO , IRBIT KO , and controls. In contrast, exon 2 of the INS1 and INS2 genes was more extensively methylated in RyR2 KO and IRBIT KO cells than in controls. Proteomics analysis using LC-MS/MS revealed that deletion of RyR2 or IRBIT resulted in differential regulation of 314 and 137 proteins, respectively, with 41 in common. These results suggest that RyR2 regulates IRBIT levels and activity in INS-1 cells, and together maintain insulin content and secretion, and regulate the proteome, perhaps via DNA methylation. One sentence Summary Deletion of RyR2 from INS-1 cells had the unanticipated effect of reducing IRBIT proteins levels, and both RyR2 and IRBIT contribute to maintenance of glucose- stimulated insulin secretion.