High-throughput proteomics approaches have revolutionised the identification of RNA-binding proteins (RBPome) and RNA-binding sequences (RBDome) across organisms. Yet, the extent of noise, including false positives, associated with these methodologies, is difficult to quantify as experimental approaches for validating the results are generally low throughput. To address this, we introduce pyRBDome, a pipeline for enhancing RNA-binding proteome data in silico. It aligns the experimental results with RNA-binding site (RBS) predictions from distinct machine-learning tools and integrates high-resolution structural data when available. Its statistical evaluation of RBDome data enables quick identification of likely genuine RNA-binders in experimental datasets. Furthermore, by leveraging the pyRBDome results, we have enhanced the sensitivity and specificity of RBS detection through training new ensemble machine-learning models. pyRBDome analysis of a human RBDome dataset, compared with known structural data, revealed that although UV–cross-linked amino acids were more likely to contain predicted RBSs, they infrequently bind RNA in high-resolution structures. This discrepancy underscores the limitations of structural data as benchmarks, positioning pyRBDome as a valuable alternative for increasing confidence in RBDome datasets.

High-throughput proteomics approaches have revolutionised the identification of RNA-binding proteins (RBPome) and RNA-binding sequences (RBDome) across organisms. Many novel putative RNA-binding proteins (RBPs) were discovered, including those that lack recognisable RNA-binding domains. Yet the extent of noise, including false-positive identifications, associated with these methodologies is difficult to quantify as experimental approaches for validating the results are generally low throughput. To address this, we introduce pyRBDome, a pipeline for in-depth in silico enhancement of RNA-binding proteome data. It does so by comparing experimental results with RNA-binding site (RBS) predictions from several distinct machine learning tools and integrates high-resolution structural data of protein-RNA complexes when available. By providing a statistical evaluation of RBDome data, users can rapidly identify protein sequences from RBDome experiments most likely to be bona fide RNA-binders. Furthermore, by leveraging the predictions collated by pyRBDome, we have enhanced the sensitivity and specificity of RBS detection through training new ensemble machine learning models. We describe a pyRBDome analysis of a large human RBDome dataset and conducted a comparision with know structural data. These analyses reinforced the significance of stacking interactions in UV cross-linking protein-RNA interactions. Surprisingly, our analyses revealed two contrasting findings: While UV cross-linked amino acids were more likely to contain predicted RBSs, they infrequently bind RNA in high-resolution structures. Given the known limitations of structural data as benchmarks, these finding highlights the utility of pyRBDome as a valuable alternative approach for enhancing confidence in RBDome datasets. Finally, our comprehensive analysis of hundreds of (putative) RBPs offers a valuable resource for RBP enthusiasts.

Abstract The cGAS/STING pathway, part of the innate immune response to foreign DNA, is known to be activated by cell’s own DNA arising from the processing of the genome, including the excision of nascent DNA at arrested replication forks. We found STING activation to affect nascent DNA processing, suggesting a novel, unexpected feedback connection between the two events. Depletion of STING suppressed and re-expression of the protein in STING-deficient cells upregulated degradation of nascent DNA. Fork arrest was accompanied by the STING pathway activation, and a STING mutant that does not activate the pathway failed to upregulate nascent strand degradation. Consistent with this, cells expressing the STING mutant had a reduced level of RPA on parental and nascent DNA of arrested forks as well as a reduced CHK1 activation compared to the cells with wild type STING. Together our findings reveal a novel connection between replication stress and innate immunity.