Interstrand cross-links (ICLs) are an extremely toxic class of DNA damage incurred during normal metabolism or cancer chemotherapy. ICLs covalently tether both strands of duplex DNA, preventing the strand unwinding that is essential for polymerase access. The mechanism of ICL repair in mammalian cells is poorly understood. However, genetic data implicate the Ercc1-Xpf endonuclease and proteins required for homologous recombination-mediated double-strand break (DSB) repair. To examine the role of Ercc1-Xpf in ICL repair, we monitored the phosphorylation of histone variant H2AX (gamma-H2AX). The phosphoprotein accumulates at DSBs, forming foci that can be detected by immunostaining. Treatment of wild-type cells with mitomycin C (MMC) induced gamma-H2AX foci and increased the amount of DSBs detected by pulsed-field gel electrophoresis. Surprisingly, gamma-H2AX foci were also induced in Ercc1(-/-) cells by MMC treatment. Thus, DSBs occur after cross-link damage via an Ercc1-independent mechanism. Instead, ICL-induced DSB formation required cell cycle progression into S phase, suggesting that DSBs are an intermediate of ICL repair that form during DNA replication. In Ercc1(-/-) cells, MMC-induced gamma-H2AX foci persisted at least 48 h longer than in wild-type cells, demonstrating that Ercc1 is required for the resolution of cross-link-induced DSBs. MMC triggered sister chromatid exchanges in wild-type cells but chromatid fusions in Ercc1(-/-) and Xpf mutant cells, indicating that in their absence, repair of DSBs is prevented. Collectively, these data support a role for Ercc1-Xpf in processing ICL-induced DSBs so that these cytotoxic intermediates can be repaired by homologous recombination.

The tumor suppressor BRCA2 is essential for homologous recombination, replication fork stability and DNA interstrand crosslink (ICL) repair in vertebrates. We show that a functionally uncharacterized protein, HSF2BP, is involved in a novel, direct and highly evolutionarily conserved interaction with BRCA2. Although HSF2BP was previously described as testis-specific, we find it is expressed in mouse ES cells, in human cancer cell lines, and in tumor samples. Elevated levels of HSF2BP sensitize human cells to ICL-inducing agents (mitomycin C and cisplatin) and PARP inhibitors, resulting in a phenotype characteristic of cells from Fanconi anemia (FA) patients. We biochemically recapitulate the suppression of ICL repair and establish that excess HSF2BP specifically compromises homologous recombination by preventing BRCA2 and RAD51 loading at the ICL. As increased ectopic expression of HSF2BP occurs naturally, we suggest that it can be considered as a causative agent in FA and a source of cancer-promoting genomic instability.

Abstract Introduction Pathogenic (P) and likely pathogenic (LP) variants in the SMAD3 gene cause Loeys-Dietz syndrome type 3 (LDS3), also known as aneurysms-osteoarthritis syndrome (AOS). The phenotype of LDS3 is highly variable and characterized by arterial aneurysms, dissections and tortuosity throughout the vascular system combined with skeletal, cutaneous and facial features. Objectives Investigate the impact of P/LP SMAD3 variants through conducting functional tests on patient-derived fibroblasts and vascular smooth muscle cells (VSMCs).The resulting knowledge will optimize interpretation of SMAD3 variants. Material and methods We conducted a retrospective analysis on clinical data from individuals with a P/LP SMAD3 variant and utilized patient-derived VSMCs to investigate the functional impacts of dominant negative (DN) and haploinsufficient (HI) variants in SMAD3. Additionally, to broaden our cell model accessibility, we performed similar functional analyses on patient-derived fibroblasts carrying SMAD3 variants, differentiating them into myofibroblasts with the same variants. This enabled us to study the functional effects of DN and HI variants in SMAD3 across both patient-derived myofibroblasts and VSMCs. Results Individuals with dominant negative (DN) variants in the MH2 protein interaction domain of SMAD3 exhibited a higher frequency of major events (66.7% vs. 44.0%, p=0.054), occurring at a younger age compared to those with haploinsufficient (HI) variants. Moreover, the age at the onset of the first major event was notably younger in individuals with DN variants in MH2, 35.0 years [IQR 29.0-47.0], compared to 46.0 years [IQR 40.0-54.0] in those with HI variants (p=0.065). In functional assays, fibroblasts carrying DN SMAD3 variants displayed reduced differentiation potential, contrasting with increased differentiation potential observed in fibroblasts with HI SMAD3 variants. Additionally, HI SMAD3 variant VSMCs showed elevated SMA expression, while exhibiting altered expression of alternative MYH11 isoforms. Conversely, DN SMAD3 variant myofibroblasts demonstrated reduced extracellular matrix (ECM) formation compared to control cell lines. These findings collectively indicate distinct functional consequences between DN and HI variants in SMAD3 across fibroblasts and VSMCs, potentially contributing to the observed differences in disease manifestation and age of onset of major events. Conclusion Distinguishing between P/LP HI and DN SMAD3 variants can be achieved by assessing differentiation potential, and evaluating SMA and MYH11 expression. Notably, myofibroblast differentiation seems to be a suitable alternative in vitro test system in comparison to VSMCs. Moreover, there is a notable trend of aortic events occurring at younger age in individuals with a DN SMAD3 variant in the MH2 domain, distinguishing them from those with a DN variant in the MH1 domain or a HI variant.

Abstract BRCA2 is an essential protein in genome maintenance, homologous recombination and replication fork protection. Its function includes multiple interaction partners and requires timely localization to relevant sites in the nucleus. We investigated the importance of the highly conserved DNA binding domain (DBD) and C-terminal domain (CTD) of BRCA2. We generated BRCA2 variants missing one or both domains in mouse ES cells and defined their contribution in HR function and dynamic localization in the nucleus, by single particle tracking of BRCA2 mobility. Changes in molecular architecture of BRCA2 induced by binding partners of purified BRCA2 was determined by scanning force microscopy. BRCA2 mobility and DNA damage-induced increase in the immobile fraction was largely unaffected by C- terminal deletions. The purified proteins missing CTD and/or DBD were defective in architectural changes correlating with reduced homologous recombination function in cells. These results emphasize BRCA2 activity at sites of damage beyond promoting RAD51 delivery.