ABSTRACT The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) efficiently into defined cardiac lineages, such as cardiomyocytes and cardiac endothelial cells, is crucial to study human heart development and model cardiovascular diseases in vitro . The mechanisms underlying the specification of these cell types during human development are not well-understood which limits fine-tuning and broader application of cardiac model systems. Here, we used the expression of ETV2, a master regulator of hematoendothelial specification in mice, to identify functionally distinct subpopulations during the co-differentiation of endothelial cells and cardiomyocytes from hiPSCs. Targeted analysis of single-cell RNA sequencing data revealed differential ETV2 dynamics in the two lineages. A newly created fluorescent reporter line allowed us to identify early lineage-predisposed states and show that a transient ETV2-high state initiates the specification of endothelial cells. We further demonstrated, unexpectedly, that functional cardiomyocytes can originate from progenitors expressing ETV2 at a low level. Our study thus sheds light on the in vitro differentiation dynamics of two important cardiac lineages. SIGNIFICANCE STATEMENT In vitro differentiation of cardiac cell types is of great importance for understanding heart development, disease modeling and future regenerative medicine. Currently, underlying molecular mechanisms are incompletely understood, which limits the efficiency and fine-tuning of present differentiation protocols. Here, we investigated the master regulator ETV2 and showed that its upregulation marks the specification of two cardiac cell types during co-differentiation. Using single-cell RNA-seq and a new fluorescent reporter line we identified lineage-predisposed subpopulations in the ETV2+ cells. We thus resolved ETV2 dynamics at the single-cell level in the context of in vitro human cardiac differentiation.

SUMMARY Inserting large DNA payloads (>10 kb) into specific genomic sites of mammalian cells remains challenging. Applications ranging from synthetic biology to evaluating the pathogenicity of disease-associated variants for precision medicine initiatives would greatly benefit from tools that facilitate this process. Here, we merge the strengths of different classes of site-specific recombinases and combine these with CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination to develop a strategy for stringent site-specific replacement of genomic fragments at least 50 kb in size in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). We demonstrate the versatility of STRAIGHT-IN ( S erine and T yrosine R ecombinase A ssisted Integration of G enes for H igh- T hroughput IN vestigation) by: (i) inserting various combinations of fluorescent reporters into hiPSCs to assess excitation-contraction coupling cascade in derivative cardiomyocytes, and; (ii) simultaneously targeting multiple variants associated with inherited cardiac arrhythmic disorder into a pool of hiPSCs. STRAIGHT-IN offers a precise approach to generate genetically-matched panels of hiPSC lines efficiently and cost-effectively.

ABSTRACT Each tissue and organ in the body has its own type of vasculature. Here we demonstrate that organotypic vasculature for the heart can be recreated in a three-dimensional cardiac microtissue (MT) model composed of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs) and endothelial cells (ECs). ECs in cardiac MTs upregulated expression of markers enriched in human intramyocardial ECs (iECs), such as CD36, CLDN5, APLNR, NOTCH4, IGFBP3, ARHGAP18 , which were previously identified in the single-cell RNA-seq dataset from the human fetal heart (6.5-7 weeks post coitum). We further show that the local microenvironment largely dictates the organ-specific identity of hiPSC-derived ECs: we compared ECs of different developmental origins derived from two distinct mesoderm subtypes (cardiac and paraxial mesoderm) and found that independent of whether the ECs were cardiac or paraxial mesoderm derived, they acquired similar identities upon integration into cardiac microtissues. This was confirmed by single-cell RNA-seq. Overall, the results indicated that whilst the initial gene profile of ECs was dictated by developmental origin, this could be modified by the local tissue environment such that the original identity was lost and the organotypic identity acquired through local environmental signals. This developmental “plasticity” in ECs has implications for multiple pathological and disease states.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can acquire chromosomal aberrations such as copy number variations during prolonged maintenance in vitro, conferring growth advantages. However, the effect of these culture-acquired mutations on the phenotypes of the differentiated hPSCs is largely unstudied. Here, we identified mosaicism in a hPSC line in which some cells showed a gain of chromosome 1q31.3. We subcloned the wild-type and variant hPSCs and could maintain both as stable lines. While both variant and wildtype lines differentiated efficiently to cardiomyocytes (hPSC-CMs), molecular analysis revealed the variant hPSC-CMs had increased expression of TNNT2, a gene encoding one of the major sarcomere proteins mediating cardiomyocyte contractility and located within the gained chromosome 1q region. Moreover, the variant hPSC-CMs showed altered contraction kinetics. Together these results highlight the importance of careful monitoring of chromosome aberrations in hPSC lines as these could have confounding effects in various applications such as disease modelling and drug discovery.

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as a powerful platform for in vitro modelling of cardiac diseases, safety pharmacology, and drug screening. All these applications require large quantities of well-characterised and standardised batches of hiPSC-CMs. Cryopreservation of hiPSC-CMs without affecting their biochemical or biophysical phenotype is essential for facilitating this, but ideally requires the cells being unchanged by the freeze-thaw procedure. We therefore compared the in vitro functional and molecular characteristics of fresh and cryopreserved hiPSC-CMs generated from two independent hiPSC lines. While the frozen hiPSC-CMs exhibited poorer replating than their freshly-derived counterparts, there was no difference in the proportion of cardiomyocytes retrieved from the mixed population when this was factored in. Interestingly, cryopreserved hiPSC-CMs from one line exhibited longer action potential durations. These results provide evidence that cryopreservation does not compromise the in vitro molecular, physiological and mechanical properties of hiPSC-CMs, though can lead to an enrichment in ventricular myocytes. It also validates this procedure for storing hiPSC-CMs, thereby allowing the same batch of hiPSC-CMs to be used for multiple applications and evaluations.

Aims: Long QT syndrome type 2 (LQT2) is caused by mutations in the gene KCNH2, encoding the hERG ion channel. Clinically, mild and severe phenotypes are associated with this cardiac channelopathy, complicating efforts to predict patient risk. The location of the mutation within KCNH2 contributes to this variable disease manifestation. Here we determined whether such phenotypic differences could be detected in cardiomyocytes derived from isogenic human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) genetically edited to harbour a range of KCNH2 mutations. Methods and Results: The hiPSC lines heterozygous for missense mutations either within the pore or tail region of the ion channel were generated using CRISPR-Cas9 editing and subsequently differentiated to cardiomyocytes (hiPSC-CMs) for functional assessment. Electrophysiological analysis confirmed the mutations prolonged the action potentials and field potentials of the hiPSC-CMs, with differences detected between the pore and tail region mutations when measured as paced 2D monolayers. This was also reflected in the cytosolic Ca2+ transients and contraction kinetics of the different lines. Pharmacological blocking of the hERG channel in the hiPSC-CMs also revealed that mutations in the pore-loop region conferred a greater susceptibility to arrhythmic events. Conclusion: These findings establish that subtle phenotypic differences related to the location of the KCNH2 mutation in LQT2 patients are reflected in hiPSC-CMs under genetically controlled conditions. Moreover, the results validate hiPSC-CMs as a strong candidate for evaluating the underlying severity of individual KCNH2 mutations in humans which could ultimately facilitate patient risk stratification. Translational Perspective: Clinical management of patients diagnosed with cardiac channelopathy diseases such as LQT2 is complicated by the variable disease phenotypes observed among mutation carriers, creating challenges for diagnosis, risk stratification and treatment. The genotype of the patient contributes to this clinical heterogeneity, with the influence of the mutation's location within KCNH2 on a patient's risk of a cardiac event being an example. Here we demonstrate that under stringently controlled genetic and experimental conditions, hiPSC-CMs are able to reflect these subtle genotype-phenotype differences, thereby providing new opportunities to stratify and potentially lessen sudden cardiac death risk amongst KCNH2 mutation carriers.