Abstract Intrinsically disordered proteins (IDPs) play a crucial role in various biological phenomena, dynamically changing their conformations in response to external environmental cues. To gain a deeper understanding of these proteins, it is essential to identify the determinants that fix their structures at the atomic level. Here, we developed a pipeline for rapid crystal structure analysis of IDP using a cell-free protein crystallization (CFPC) method. Through this approach, we successfully demonstrated the determination of the structure of an IDP to uncover the key determinants that stabilize its conformation. Specifically, we focused on the 11-residue fragment of c-Myc, which forms an α-helix through dimerization with a binding partner protein. This fragment was strategically fused with an in-cell crystallizing protein and was expressed in a cell-free system. The resulting crystal structures of the c-Myc fragment were successfully determined at a resolution of 1.92 Å and we confirmed that they are identical to the structures of the complex with the native binding partner protein. This indicates that the environment of the scaffold crystal can fix the structure of c-Myc. Significantly, these crystals were obtained directly from a small reaction mixture (30 μL) incubated for only 72 hours. Analysis of 8 crystal structures derived from 22 mutants revealed two hydrophobic residues as the key determinants responsible for stabilizing the α-helical structure. These findings underscore the power of our CFPC screening method as a valuable tool for determining the structures of challenging target proteins and elucidating the essential molecular interactions that govern their stability.

Abstract In-cell protein crystallization (ICPC) has attracted attention as a next-generation structural biology tool because it does not require multistep purification processes and large-scale crystallization screenings. However, significant issues remain to be solved in context of obtaining various protein crystals in sufficient amounts and quality for structure determination by ICPC. Here, we report the development of cell-free protein crystallization (CFPC), a direct protein crystallization technique which uses cell-free protein synthesis. The most crucial advantages of CFPC are that the reaction scale and time can be minimized and that various reagents can be added during the reaction. We obtained high-quality nano-sized polyhedra crystals, which are produced in insect cells by infection with cytoplasmic polyhedrosis virus, at a 200 μL reaction scale within 6 h. We applied this technology to structure determination of crystalline inclusion protein A (CipA) by suppressing twin crystal formation with addition of an inhibitor to the reaction solution. We succeeded in determining a 2.11 Å resolution structure from the nanocrystals of CipA. This technology, which integrates in-cell and in vitro crystallizations significantly expands the tools available for high throughput protein structure determination, particularly in context of unstable, low-yield, or substrate-binding proteins, which are difficult to analyze by conventional methods.