Abstract The type VI secretion system (T6SS) is a double-tubular toxin-injection nanomachine widely found in gram-negative human and plant pathogens. The current model depicts that the T6SS spear-like Hcp tube is powered by the contraction of an outer sheath to drill through the envelope of a neighboring cell, achieving cytosol to cytosol delivery. However, gram-positive bacteria seem to be impenetrable to such T6SS action. Here we report that a plant pathogen Acidovorax citrulli (AC) deploys a highly potent T6SS to kill a range of bacteria including Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Bacillus subtilis , and Mycobacterium smegmatis as well as fungal species including Candida albicans and Pichia pastoris . Using bioinformatic and biochemical assays, we identified a group of T6SS effectors and characterized one effector RhsB that is critical for interspecies interaction. We report that RhsB contains a conserved YD-repeat domain and a C-terminal nuclease domain. Toxicity of RhsB was neutralized by its downstream immunity proteins through direct interaction. RhsB was cleaved at the C-terminal end and a catalytic mutation within the internal aspartic protease abolished such cleavage. Collectively, the T6SS of AC displays potent activities to penetrate the cell envelope barriers of gram-positive and fungal species, highlighting the greatly expanded capabilities of T6SS in modulating microbiome compositions in complex environments.

Abstract Vibrio cholerae , the etiological pathogen of cholera, relies on its type VI secretion system (T6SS) as an effective weapon to survive in highly competitive communities. The anti-bacterial and anti-eukaryotic functions of T6SS depend on its secreted effectors that target multiple essential cellular processes. However, the mechanisms that account for effector diversity and different effectiveness during interspecies competition remain elusive. Here, we report that environmental cations and temperature play a key role in dictating effector-mediated competition of Vibrio cholerae . We found that V. cholerae could employ its cell-wall-targeting effector TseH to outcompete the otherwise resistant Escherichia coli and the V. cholerae immunity deletion mutant ΔtsiH when Ca 2+ and Mg 2+ were supplemented. The E. coli Δ phoQ mutant was more sensitive to TseH-mediated killing during competition, suggesting the metal-sensing PhoPQ two-component system is protective to E. coli from TseH activity. Using transcriptome analysis, we found multiple stress response systems, including acid stress response, oxidative stress response, and osmotic stress response, were activated in E. coli expressing TseH in comparison with E. coli expressing the inactive mutant TseH H64A . The membrane-targeting lipase effector TseL also exhibited reduced killing against E. coli when divalent cations were removed. In addition, competition analysis of E. coli with V. cholerae single-effector active strains reveals a temperature-dependent susceptibility of E. coli to effectors, VasX, VgrG3, and TseL. These findings suggest that abiotic factors, that V. cholerae frequently encounters in natural habitats, play a crucial role in dictating the competitive fitness conferred by the type VI secretion system in complex multispecies communities.

Abstract The type VI secretion system (T6SS) is one of the most powerful nanomachines employed by Gram-negative pathogens for penetrating diverse cell envelopes, including bacteria and fungi, to deliver potent effectors into target cells. While the membrane-anchored contractile tubular structure of the T6SS is well characterized, the assembly process remains poorly understood. The prevailing model suggests that the assembly of T6SS initiates from its outer-membrane component. Here, we report a distinct model that the cytoplasmic protein Fha initiates T6SS assembly in Acidovorax citrulli , an important plant pathogen. Fha dictates the formation of the inner-membrane complex and the baseplate, and directly interacts with these key components. Importantly, imaging and biochemical assays reveal that Fha undergoes liquid-liquid phase separation (LLPS), forming condensates that selectively recruit essential T6SS proteins, which are otherwise dispersed in cells. Fha also exhibited conserved functions in human pathogens Vibrio cholerae and Pseudomonas aeruginosa . These findings unveil an inside-first LLPS-driven model for T6SS assembly and suggest LLPS might be broadly involved in mediating the assembly of bacterial macromolecular complexes and facilitating interspecies interactions and pathogenesis. Significance statement The T6SS plays a pivotal role in interspecies competition and host-microbe interactions by delivering toxins to various prokaryotes and eukaryotes. Its crucial function relies on a membrane-anchored macromolecular structure comprising at least 13 conserved components. However, the mechanisms governing the efficient assembly of its diverse cytosolic and membrane-bound components remain elusive. Here, we identify Fha, a conserved cytosolic protein, as a key initiator of T6SS assembly. Fha recruits multiple structural and effector components, forming LLPS condensates. Fha homologs of plant and human pathogens exhibit conserved functions. Our findings not only unveil an inside-first assembly model for the T6SS, initiating from inner-membrane and baseplate components, but also suggest LLPS may have a broader impact on bacterial physiology beyond intracellular activities.

Abstract Peptidoglycan (PG) serves as an essential target for antimicrobial development. An overlooked reservoir of antimicrobials lies in the form of PG-hydrolyzing enzymes naturally produced for polymicrobial competition, particularly those associated with the type VI secretion system (T6SS). Here we report that a T6SS effector TseP, from Aeromonas dhakensis , represents a family of effectors with dual amidase-lysozyme activities. In vitro PG-digestion coupled with LC-MS analysis revealed the N-domain’s amidase activity, which is neutralized by either catalytic mutations or the presence of the immunity protein TsiP. The N-domain, but not the C-domain, of TseP is sufficient to restore T6SS secretion in T6SS-defective mutants, underscoring its critical structural role. Using pull-down and secretion assays, we showed that these two domains interact directly with a carrier protein VgrG2 and can be secreted separately. Homologs in Aeromonas hydrophila and Pseudomonas syringae exhibited analogous dual functions. Additionally, N- and C-domains display distinctive GC contents, suggesting an evolutionary fusion event. By altering the surface charge through structural-guided design, we engineered the TseP C4+ effector that successfully lyses otherwise resistant Bacillus subtilis cells, enabling the T6SS to inhibit B. subtilis in a contact-independent manner. This research uncovers TseP as a new family of bifunctional chimeric effectors targeting PG, offering a potential strategy to harness these proteins in the fight against antimicrobial resistance. Significance Statement Antimicrobial resistance urgently demands global interventions, and the bacteria cell wall remains a promising target. Our research introduces a novel family of bifunctional, cell-wall-damaging T6SS effectors. More importantly, we demonstrate an effective strategy to enable an otherwise ineffective enzyme to target both Gram-negative and Gram-positive bacteria. Our findings highlight a promising path forward using cell-wall-damaging effectors, a largely untapped resource, in the fight against antimicrobial resistance.