Alzheimer disease (AD) is characterized by deposits of an aggregated 42-amino-acid beta-amyloid peptide (beta AP) in the brain and cerebrovasculature. After a concentration-dependent lag period during in vitro incubations, soluble preparations of synthetic beta AP slowly form fibrillar aggregates that resemble natural amyloid and are measurable by sedimentation and thioflavin T-based fluorescence. Aggregation of soluble beta AP in these in vitro assays is enhanced by addition of small amounts of pre-aggregated beta-amyloid "seed" material. We also have prepared these seeds by using a naturally occurring reaction between glucose and protein amino groups resulting in the formation of advanced "glycosylation" end products (AGEs) which chemically crosslink proteins. AGE-modified beta AP-nucleation seeds further accelerated aggregation of soluble beta AP compared to non-modified "seed" material. Over time, nonenzymatic advanced glycation also results in the gradual accumulation of a set of posttranslational covalent adducts on long-lived proteins in vivo. In a standardized competitive ELISA, plaque fractions of AD brains were found to contain about 3-fold more AGE adducts per mg of protein than preparations from healthy, age-matched controls. These results suggest that the in vivo half-life of beta-amyloid is prolonged in AD, resulting in greater accumulation of AGE modifications which in turn may act to promote accumulation of additional amyloid.

Senile plaques and neurofibrillary tangles, the two hallmark lesions of Alzheimer's disease, are the results of the pathological deposition of proteins normally present throughout the brain. Senile plaques are extracellular deposits of fibrillar β-amyloid peptide (Aβ); neurofibrillary tangles represent intracellular bundles of self-assembled hyperphosphorylated tau proteins. Although these two lesions are often present in the same brain areas, a mechanistic link between them has yet to be established. In the present study, we analyzed whether tau plays a key role in fibrillar Aβ-induced neurite degeneration in central neurons. Cultured hippocampal neurons obtained from wild-type, tau knockout, and human tau transgenic mice were treated with fibrillar Aβ. Morphological analysis indicated that neurons expressing either mouse or human tau proteins degenerated in the presence of Aβ. On the other hand, tau-depleted neurons showed no signs of degeneration in the presence of Aβ. These results provide direct evidence supporting a key role for tau in the mechanisms leading to Aβ-induced neurodegeneration in the central nervous system. In addition, the analysis of the composition of the cytoskeleton of tau-depleted neurons suggested that the formation of more dynamic microtubules might confer resistance to Aβ-mediated neurodegeneration.

We have analyzed the modulation of amyloid beta-protein precursor (APP) gene expression in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The level of the APP mRNA transcripts increased as HUVEC reached confluency. In confluent culture the half-life of the APP mRNA was 4 hr. Treatment of the cells with human-recombinant interleukin 1 (IL-1), phorbol 12-myristate 13-acetate, or heparin-binding growth factor 1 enhanced the expression of APP gene in these cells, but calcium ionophore A23187 and dexamethasone did not. The protein kinase C inhibitor 1-(isoquinolinsulfonyl)-2-methylpiperazine (H7) inhibited IL-1-mediated increase of the level of APP transcripts. To map IL-1-responsive elements of the APP promoter, truncated portions of the APP promoter were fused to the human growth hormone reporter gene. The recombinant plasmids were transfected into mouse neuroblastoma cells, and the cell medium was assayed for the human growth hormone. A 180-base-pair region of the APP promoter located between position -485 and -305 upstream from the transcription start site was necessary for IL-1-mediated induction of the reporter gene. This region contains the upstream transcription factor AP-1 binding site. These results suggest that IL-1 upregulates APP gene expression in HUVEC through a pathway mediated by protein kinase C, utilizing the upstream AP-1 binding site of the APP promoter.

The pathogenesis of Alzheimer's disease is characterized by the aggregation and fibrillation of the 40-residue A beta(1-40) and 42-residue A beta(1-42) peptides into amyloid plaques. The structural changes associated with the conversion of monomeric A beta peptide building blocks into multimeric fibrillar beta-strand aggregates remain unknown. Recently, we established that oxidation of the methionine-35 side chain to the sulfoxide (Met35(red) --> Met35(ox)) significantly impedes the rate of aggregation and fibrillation of the A beta peptide. To explore this effect at greater resolution, we carefully compared the (1)H, (15)N, and (13)C NMR chemical shifts of four A beta peptides that had the Met35 reduced or oxidized (A beta(1-40)Met35(red), A beta(1-40)Met35(ox), A beta(1-42)Met35(red), and A beta(1-42)Met35(ox)). With the use of a special disaggregation protocol, the highly aggregation prone A beta peptides could be studied at higher, millimolar concentrations (as required by NMR) in aqueous solution at neutral pH, remaining largely monomeric at 5 degrees C as determined by sedimentation equilibrium studies. The NOE, amide-NH temperature coefficients, and chemical shift indices of the (1)H alpha, (13)C alpha, and (13)C beta established that the four peptides are largely random, extended chain structures, with the Met35(ox) reducing the propensity for beta-strand structure at two hydrophobic regions (Leu17-Ala21 and Ile31-Val36), and turn- or bendlike structures at Asp7-Glu11 and Phe20-Ser26. Additional NMR studies monitoring changes that occur during aging at 37 degrees C established that, along with a gradual loss of signal/noise, the Met35(ox) significantly hindered upfield chemical shift movements of the 2H NMR signals for the His6, His13, and His14 side chains. Taken together, the present NMR studies demonstrate that the Met35(red) --> Met35(ox) conversion prevents aggregation by reducing both hydrophobic and electrostatic association and that the A beta(1-40)Met35(red), A beta(1-40)Met35(ox), A beta(1-42)Met35(red), and A beta(1-42)Met35(ox) peptides may associate differently, through specific, sharp changes in structure during the initial stages of aggregation.

ABSTRACT Conflicting evidence supports a role for tau as an essential neuronal cytoskeletal protein or as a redundant protein whose function can be fulfilled by other microtubule-associated proteins. To investigate the function of tau in axonogenesis, we created tau deficient mice by disrupting the TAU gene. The engineered mice do not express the tau protein, appear physically normal and are able to reproduce. In contrast to a previously reported tau knockout mouse, embryonic hippocampal cultures from tau deficient mice show a significant delay in maturation as measured by axonal and neuritic extensions. The classic technique of selectively enhancing axonal growth by growth on laminin substrates failed to restore normal neuronal maturation of tau knockout neurons. By mating human TAU-gene transgenic and tau knockout mice, we reconstituted tau-deficient neurons with human tau proteins and restored a normal pattern of axonal growth and neuronal maturation. The ability of human tau proteins to rescue tau-deficient mouse neurons confirms that tau expression affects the rate of neurite extension.

Neurofibrillary tangles (NFTs) are composed of abnormal aggregates of the cytoskeletal protein tau. Together with amyloid β (Aβ) plaques and neuronal and synaptic loss, NFTs constitute the primary pathological hallmarks of Alzheimer disease (AD). Recent evidence also suggests that caspases are activated early in the progression of AD and may play a role in neuronal loss and NFT pathology. Here we demonstrate that tau is cleaved at D421 (ΔTau) by executioner caspases. Following caspase-cleavage, ΔTau facilitates nucleation-dependent filament formation and readily adopts a conformational change recognized by the early pathological tau marker MC1. ΔTau can be phosphorylated by glycogen synthase kinase-3β and subsequently recognized by the NFT antibody PHF-1. In transgenic mice and AD brains, ΔTau associates with both early and late markers of NFTs and is correlated with cognitive decline. Additionally, ΔTau colocalizes with Aβ1–42 and is induced by Aβ1–42 in vitro. Collectively, our data imply that Aβ accumulation triggers caspase activation, leading to caspase-cleavage of tau, and that this is an early event that may precede hyperphosphorylation in the evolution of AD tangle pathology. These results suggest that therapeutics aimed at inhibiting tau caspase-cleavage may prove beneficial not only in preventing NFT formation, but also in slowing cognitive decline.

Thinning and discontinuities within the vascular basement membrane (VBM) are associated with leakage of the plasma protein prothrombin across the blood–brain barrier (BBB) in Alzheimer's disease (AD). Prothrombin immunohistochemistry and ELISA assays were performed on prefrontal cortex. In severe AD, prothrombin was localized within the wall and neuropil surrounding microvessels. Factor VIII staining in severe AD patients indicated that prothrombin leakage was associated with shrinkage of endothelial cells. ELISA revealed elevated prothrombin levels in prefrontal cortex AD cases that increased with the Braak stage (Control = 1.39, I–II = 1.76, III–IV = 2.28, and V–VI = 3.11 ng prothrombin/mg total protein). Comparing these four groups, there was a significant difference between control and Braak V–VI (p = 0.0095) and also between Braak stages I–II and V–VI (p = 0.0048). There was no significant difference in mean prothrombin levels when cases with versus without cerebral amyloid angiopathy (CAA) were compared (p-value = 0.3627). When comparing AD patients by APOE genotype (ApoE3,3 = 2.00, ApoE3,4 = 2.49, and ApoE4,4 = 2.96 ng prothrombin/mg total protein) an analysis of variance indicated a difference between genotypes at the 10% significance level (p = 0.0705). Tukey's test indicated a difference between the 3,3 and 4,4 groups (p = 0.0607). These studies provide evidence that in advanced AD (Braak stage V–VI), plasma proteins like prothrombin can be found within the microvessel wall and surrounding neuropil, and that leakage of the blood–brain barrier may be more common in patients with at least one APOE4 allele.

Neurofibrillary tangles (NFTs) are composed of abnormal aggregates of the cytoskeletal protein tau. Together with amyloid β (Aβ) plaques and neuronal and synaptic loss, NFTs constitute the primary pathological hallmarks of Alzheimer disease (AD). Recent evidence also suggests that caspases are activated early in the progression of AD and may play a role in neuronal loss and NFT pathology. Here we demonstrate that tau is cleaved at D421 (ΔTau) by executioner caspases. Following caspase-cleavage, ΔTau facilitates nucleation-dependent filament formation and readily adopts a conformational change recognized by the early pathological tau marker MC1. ΔTau can be phosphorylated by glycogen synthase kinase-3β and subsequently recognized by the NFT antibody PHF-1. In transgenic mice and AD brains, ΔTau associates with both early and late markers of NFTs and is correlated with cognitive decline. Additionally, ΔTau colocalizes with Aβ1–42 and is induced by Aβ1–42 in vitro. Collectively, our data imply that Aβ accumulation triggers caspase activation, leading to caspase-cleavage of tau, and that this is an early event that may precede hyperphosphorylation in the evolution of AD tangle pathology. These results suggest that therapeutics aimed at inhibiting tau caspase-cleavage may prove beneficial not only in preventing NFT formation, but also in slowing cognitive decline.

The cardinal pathological features of Alzheimer disease are depositions of aggregated amyloid beta protein (A beta) in the brain and cerebrovasculature. However, the A beta is found in a soluble form in cerebrospinal fluid in healthy individuals and patients with Alzheimer disease. We postulate that sequestration of A beta precludes amyloid formation. Failure to sequester A beta in Alzheimer disease may result in amyloidosis. When we added A beta to cerebrospinal fluid of patients and controls it was rapidly sequestered into stable complexes with transthyretin. Complexes with apolipoprotein E, which has been shown to bind A beta in vitro, were not observed in cerebrospinal fluid. Additional in vitro studies showed that both purified transthyretin and apolipoprotein E prevent amyloid formation.

Microglia are associated with neuritic plaques in Alzheimer disease (AD) and serve as a primary component of the innate immune response in the brain. Neuritic plaques are fibrous deposits composed of the amyloid beta-peptide fragments (Abeta) of the amyloid precursor protein (APP). Numerous studies have shown that the immune cells in the vicinity of amyloid deposits in AD express mRNA and proteins for pro-inflammatory cytokines, leading to the hypothesis that microglia demonstrate classical (Th-1) immune activation in AD. Nonetheless, the complex role of microglial activation has yet to be fully explored since recent studies show that peripheral macrophages enter an "alternative" activation state.To study alternative activation of microglia, we used quantitative RT-PCR to identify genes associated with alternative activation in microglia, including arginase I (AGI), mannose receptor (MRC1), found in inflammatory zone 1 (FIZZ1), and chitinase 3-like 3 (YM1).Our findings confirmed that treatment of microglia with anti-inflammatory cytokines such as IL-4 and IL-13 induces a gene profile typical of alternative activation similar to that previously observed in peripheral macrophages. We then used this gene expression profile to examine two mouse models of AD, the APPsw (Tg-2576) and Tg-SwDI, models for amyloid deposition and for cerebral amyloid angiopathy (CAA) respectively. AGI, MRC1 and YM1 mRNA levels were significantly increased in the Tg-2576 mouse brains compared to age-matched controls while TNFalpha and NOS2 mRNA levels, genes commonly associated with classical activation, increased or did not change, respectively. Only TNFalpha mRNA increased in the Tg-SwDI mouse brain. Alternative activation genes were also identified in brain samples from individuals with AD and were compared to age-matched control individuals. In AD brain, mRNAs for TNFalpha, AGI, MRC1 and the chitinase-3 like 1 and 2 genes (CHI3L1; CHI3L2) were significantly increased while NOS2 and IL-1beta mRNAs were unchanged.Immune cells within the brain display gene profiles that suggest heterogeneous, functional phenotypes that range from a pro-inflammatory, classical activation state to an alternative activation state involved in repair and extracellular matrix remodeling. Our data suggest that innate immune cells in AD may exhibit a hybrid activation state that includes characteristics of classical and alternative activation.