Somatic mutations in mononucleotide repeats are commonly used to assess the mismatch repair status of tumours. Current tests focus on repeats with a length above 15bp, which tend to be somatically more unstable than shorter ones. These longer repeats also have a substantially higher PCR error rate and tests that use capillary electrophoresis for fragment size analysis often require expert interpretation. In this communication, we present a panel of 17 short repeats (length 7-12bp) for sequence-based microsatellite instability (MSI) testing. Using a simple scoring procedure that incorporates the allelic distribution of the mutant repeats, and analysis of two cohort of tumours totalling 209 samples, we show that this panel is able to discriminate between MMR proficient and deficient tumours, even when constitutional DNA is not available. In the training cohort, the method achieved 100% concordance with fragment analysis, while in the testing cohort, 4 discordant samples were observed (corresponding to 97% concordance). Of these, 2 showed discrepancies between fragment analysis and immunohistochemistry and one was reclassified after re-testing using fragment analysis. These results indicate that our approach offers the option of a reliable, scalable routine test for MSI.

Background: Clinical guidelines recommend microsatellite instability (MSI) and BRAF V600E testing of all colorectal cancers (CRCs) to screen for Lynch syndrome (LS), a hereditary predisposition to cancer. MSI is also associated with response to immunotherapy. However, uptake of MSI testing is poor and current assays are not suitable for high throughput diagnostics. We aimed to develop a cheap and scalable sequencing assay for MSI classification, which is robust to variables in clinical samples and simultaneously tests for BRAF V600E to streamline the LS screening pipeline. Methods: 24 short (7-12bp) microsatellites and the BRAF V600E locus were amplified in multiplex using single molecule molecular inversion probes (smMIPs) and sequenced using the Illumina MiSeq platform. Reads were aligned to reference genome hg19. An MSI classifier was trained from 98 CRCs and validated in 99 independent CRCs collected in pathology laboratories in Edinburgh, Spain and Newcastle. Results: The smMIP-based MSI assay has 100% accuracy for MSI status relative to MSI Analysis System (Promega). MSI classification is reproducible (100% concordance) and is robust to sample variables, detecting less than 5% MSI-high content in template DNA and giving reliable classification from sequencing only 75 DNA molecules per marker. BRAF V600E was detected with mutant allele frequencies down to 1.7%. Conclusions: Our short microsatellite, smMIP-based, MSI assay provides a cheap and fully automatable assessment of MSI status and BRAF mutation. It is readily scalable to high throughput cancer diagnostics, and is suitable both as a companion diagnostic for immunotherapy and for streamlined LS screening.