Graph theoretical analysis has become an important tool in the examination of brain dysconnectivity in neurological and psychiatric brain disorders. A common analysis step in the construction of the functional graph or network involves “thresholding” of the connectivity matrix, selecting the set of edges that together form the graph on which network organization is evaluated. To avoid systematic differences in absolute number of edges, studies have argued against the use of an “absolute threshold” in case-control studies and have proposed the use of “proportional thresholding” instead, in which a pre-defined number of strongest connections are selected as network edges, ensuring equal network density across datasets. Here, we systematically studied the effect of proportional thresholding on the construction of functional matrices and subsequent graph analysis in patient-control functional connectome studies. In a few simple experiments we show that differences in overall strength of functional connectivity (FC) – as often observed between patients and controls – can have predictable consequences for between-group differences in network organization. In individual networks with lower overall FC the proportional thresholding algorithm has to select more edges based on lower correlations, which have (on average) a higher probability of being spurious, and thus introduces a higher degree of randomness in the resulting network. We show across both empirical and artificial patient-control datasets that lower levels of overall FC in either the patient or control group will most often lead to differences in network efficiency and clustering, suggesting that differences in FC across subjects will be artificially inflated or translated into differences in network organization. Based on the presented case-control findings we inform about the caveats of proportional thresholding in patient-control studies in which groups show a between-group difference in overall FC. We make recommendations on how to examine, report and to take into account overall FC effects in future patient-control functional connectome studies.

The position of the mitotic spindle is tightly controlled in animal cells, as it determines the plane and orientation of cell division. Interactions between cytoplasmic dynein at the cortex and astral microtubules generate pulling forces that position the spindle. In yeast, dynein is actively delivered to the cortex through microtubule plus-end tracking complexes. In animal cells, an evolutionarily conserved Gα-GPR-1/2Pins/LGN-LIN-5NuMA cortical complex interacts with dynein and is required to generate pulling forces, but the mechanism of dynein recruitment to the cortex is unclear. Using CRISPR/Cas9-assisted recombineering, we fluorescently labeled endogenous DHC-1 dynein in C. elegans. We observed strong dynein plus-end tracking, which depended on the end-binding protein EBP-2. Complete removal of the EBP family abolished dynein plus-end tracking but not LIN-5-dependent cortical localization. The ebp-1/2/3 deletion mutant, which was viable and fertile, showed increased cortical microtubule retention; however, pulling forces and spindle positioning were normal. These data indicate that dynein recruited from the cytoplasm creates robust pulling forces.

Abstract The conserved adapter protein Scribble (Scrib) plays essential roles in a variety of cellular processes, including polarity establishment, proliferation, and directed cell migration. While the mechanisms through which Scrib promotes epithelial polarity are beginning to be unraveled, its roles in other cellular processes including cell migration remain enigmatic. In C. elegans , the Scrib ortholog LET-413 is essential for apical–basal polarization and junction formation in embryonic epithelia. However, whether LET-413 is required for postembryonic development or plays a role in migratory events is not known. Here, we use inducible protein degradation to investigate the functioning of LET-413 in larval epithelia. We find that LET-413 is essential in the epidermal epithelium for growth, viability, and junction maintenance. In addition, we identify a novel role for LET-413 in the polarized outgrowth of the epidermal seam cells. These stem cell-like epithelial cells extend anterior and posterior directed apical protrusions in each larval stage to reconnect to their neighbors. We show that the role of LET-413 in seam cell outgrowth is mediated at least in part by the junctional component DLG-1 discs large, which appears to restrict protrusive activity to the apical domain. Finally, we demonstrate that the Rho-family GTPases CED-10 Rac and CDC-42 can regulate seam cell outgrowth and may also function downstream of LET-413. Our data uncover multiple essential functions for LET-413 in larval development and shed new light on the regulation of polarized outgrowth of the seam cells.

The position of the mitotic spindle determines the plane of cell cleavage, and thereby the location, size, and content of daughter cells. Spindle positioning is driven by dynein-mediated pulling forces exerted on astral microtubules. This process requires an evolutionarily conserved complex of α-GDP, GPR-1,2/Pins/LGN, and LIN-5/Mud/NuMA proteins. It remains unknown whether this complex merely forms a membrane anchor for dynein, or whether the individual components have additional functions, for instance through Gα-GTP or dynein activation. To functionally dissect this system, we developed a genetic strategy for light-controlled localization of endogenous proteins in C. elegans embryos. Controlled germline expression and membrane recruitment of the Gα; regulators RIC-8/Ric-8A and RGS-7/Loco/RGS3, and replacement of Gα with a light-inducible membrane anchor demonstrated that Gα-GTP signaling is dispensable for pulling force generation. In the absence of Gα, cortical recruitment of GPR-1,2 or LIN-5, but not dynein itself, induced high pulling forces. Local recruitment of LIN-5 overruled normal cell-cycle and polarity regulation, and provided experimental control over the spindle and cell cleavage plane. Our results define Gα-GDP-GPR-1,2/Pins/LGN as a regulatable membrane anchor, and LIN-5/Mud/NuMA as a potent activator of dynein-dependent spindle positioning forces. This study also highlights the possibilities for optogenetic control of endogenous proteins within an animal system.

Abstract Reorganization of the plasma membrane and underlying actin cytoskeleton into specialized domains is essential for the functioning of most polarized cells in animals. Proteins of the ezrin-radixin-moesin (ERM) and Na + /H + exchanger 3 regulating factor (NHERF) family are conserved regulators of cortical specialization. ERM proteins function as membrane-actin linkers and as molecular scaffolds that organize the distribution of proteins at the membrane. NHERF proteins are PDZ-domain containing adapters that can bind to ERM proteins and extend their scaffolding capability. Here, we investigate how ERM and NHERF proteins function in regulating intestinal lumen formation in the nematode Caenorhabditis elegans. C. elegans has single ERM and NHERF family proteins, termed ERM-1 and NRFL-1, and ERM-1 was previously shown to be critical for intestinal lumen formation. Using CRISPR/Cas9-generated nrfl-1 alleles we demonstrate that NRFL-1 localizes at the intestinal microvilli, and that this localization is depended on an interaction with ERM-1. However, nrfl-1 loss of function mutants are viable and do not show defect in intestinal development. Interestingly, combining nrfl-1 loss with erm-1 mutants that either block or mimic phosphorylation of a regulatory C-terminal threonine causes severe defects in intestinal lumen formation. These defects are not observed in the phosphorylation mutants alone, and resemble the effects of strong erm-1 loss of function. The loss of NRFL-1 did not affect the localization or activity of ERM-1. Together, these data indicate that ERM-1 and NRFL-1 function together in intestinal lumen formation in C. elegans . We postulate that the functioning of ERM-1 in this tissue involves actin-binding activities that are regulated by the C-terminal threonine residue and the organization of apical domain composition through NRFL-1.

Abstract The apical domain of epithelial cells can acquire a diverse array of morphologies and functions, which is critical for the function of epithelial tissues. The Crumbs proteins are evolutionary conserved transmembrane proteins with essential roles in promoting apical domain formation in epithelial cells. The short intracellular tail of Crumbs proteins interacts with a variety of proteins, including the scaffolding protein Pals1 (protein associated with LIN7, Stardust in Drosophila ). Pals1 in turn binds to a second scaffolding protein termed PATJ (Pals1-associated tight junction protein), to form the core Crumbs/Pals1/PATJ Crumbs complex. While essential roles in epithelial organization have been shown for Crumbs proteins in Drosophila and mammalian systems, the three Caenorhabditis elegans crumbs genes are dispensable for epithelial polarization and animal development. Moreover, the presence and functioning of orthologs of Pals1 and PATJ has not been investigated. Here, we identify MAGU-2 and MPZ-1 as the C. elegans orthologs of Pals1 and PATJ, respectively. We show that MAGU-2 interacts with all three Crumbs proteins as well as MPZ-1, and localizes to the apical membrane domain in a Crumbs-dependent fashion. Similar to crumbs mutants, a magu-2 null mutant shows no developmental or epithelial polarity defects. Finally, we show that overexpression of the Crumbs proteins EAT-20 or CRB-3 in the C. elegans intestine can lead to apical membrane expansion. Our results shed light into the composition of the C. elegans Crumbs complex and indicate that the role of Crumbs proteins in promoting apical domain formation is conserved.