Abstract Here, we report an approach to detect diverse bacterial and fungal taxa in complex samples by direct analysis of community RNA in one step using NanoString probe sets. We designed rRNA-targeting probe sets to detect forty two bacterial and fungal genera or species common in cystic fibrosis (CF) sputum, and demonstrated taxon-specificity of these probes as well as a linear response over more than three logs of input RNA. Culture-based analyses correlated qualitatively with relative abundance data on bacterial and fungal taxa obtained by NanoString and the analysis of serial samples demonstrated the use of this method to simultaneously detect bacteria and fungi and to detect microbes at low abundance without an amplification step. The relative abundances of bacterial taxa detected by analysis of RNA correlated with the relative abundances of the same taxa as measured by sequencing of the V4V5 region of the 16S rRNA gene amplified from community DNA from the same sample. We propose that this method may complement other methods designed to understand dynamic microbial communities, may provide information on bacteria and fungi in the same sample with a single assay, and, with further development, may provide quick and easily-interpreted diagnostic information on diverse bacteria and fungi at the genus or species level. Importance Here we demonstrate the use of an RNA-based analysis of specific taxa of interest, including bacteria and fungi, within microbial communities. This multiplex method may be useful as a means to identify samples with specific combinations of taxa and to gain information on how specific populations vary over time and space or in response to perturbation. A rapid means to measure bacterial and fungal populations may aid in the study of host response to changes in microbial communities.

Pseudomonas aeruginosa has a broad metabolic repertoire that facilitates its co-existence with different microbes. Many microbes secrete products that P. aeruginosa can then catabolize, including ethanol, a common fermentation product. Here, we show that under oxygen limiting conditions P. aeruginosa utilizes AdhA, an NAD-linked alcohol dehydrogenase, as a previously undescribed means for ethanol catabolism. In a rich medium containing ethanol, AdhA, but not the previously described PQQ-linked alcohol dehydrogenase, ExaA, oxidizes ethanol and leads to the accumulation of acetate in culture supernatants. AdhA-dependent acetate accumulation, and the accompanying decrease in pH, promotes P. aeruginosa survival in LB-grown stationary phase cultures. The transcription of adhA is elevated by hypoxia and in anoxic conditions, and we show that it is regulated by the Anr transcription factor. We have shown that lasR mutants have higher levels of Anr-regulated transcripts in low oxygen conditions compared to their wild type counterparts. Here, we show that a lasR mutant, when grown with ethanol, has an even larger decrease in pH than WT that is dependent on both anr and adhA . The large increase in AdhA activity similar to that of a strain expressing a hyperactive Anr-D149A variant. Ethanol catabolism in P. aeruginosa by AdhA supports growth on ethanol as a sole carbon source and electron donor in oxygen-limited settings and in cells growing by denitrification in anoxic conditions. This is the first demonstration of a physiological role for AdhA in ethanol oxidation in P. aeruginosa .

Abstract Flagella are multiprotein complexes whose assembly and positioning requires complex spatiotemporal control. Flagellar assembly is thought to be controlled by several transcriptional tiers, which is mediated through various master regulators. Here, we revisited the regulation of flagellar genes in polarly flagellated gammaproteobacteria by the regulators FlrA, RpoN (σ 54 ) and FliA (σ 28 ) in Shewanella putrefaciens CN-32 at the transcript and protein level. As expected, strict control at both levels occurred for for highly abundant flagellar proteins, including the building blocks for the outer rings, rod, hook and filament. In contrast, a number of regulatory and structural proteins were always present also in the absence of the main regulators. Initiation of flagella assembly and motor activation likely relies on the abundance control of only few structural key components required for formation of the MS- and C-ring and the flagellar type III secrection system. We identified σ 70 -dependent promoters driving constitutive expression of some flagellar genes including the regulators of flagellar number and positioning, FlhF and FlhG. Reduction of the constitutive expression levels resulted in emergence of hyperflagellation. Thus, basal expression and presence of flagellar proteins is required for proper flagellation, which adds a deeper layer to the regulation of flagellar synthesis and assembly. Significance The tier-based transcriptional regulation underlying bacterial flagella synthesis is – with certain variations – well-established in various species. Here we show that initiation and proceeding of flagellar synthesis can be simply based on the control of some key components and highly abundant building blocks. We further identified a ‚tier zero’, a set of constitutively produced flagellar regulators and building blocks, which is required, for example, to maintain the flagellar counter. We expect this not only to apply to our model species Shewanella , but also to other flagella regulation systems in bacteria.