Formins play an important role in the polymerization of unbranched actin filaments, and particular formins slow elongation by 5-95%. We studied the interactions between actin and the FH2 domains of formins Cdc12, Bni1 and mDia1 to understand the factors underlying their different rates of polymerization. All-atom molecular dynamics simulations revealed two factors that influence actin filament elongation and correlate with the rates of elongation. First, FH2 domains can sterically block the addition of new actin subunits. Second, FH2 domains flatten the helical twist of the terminal actin subunits, making the end less favorable for subunit addition. Coarse-grained simulations over longer time scales support these conclusions. The simulations show that filaments spend time in states that either allow or block elongation. The rate of elongation is a time-average of the degree to which the formin compromises subunit addition rather than the formin-actin complex literally being in 'open' or 'closed' states.

The microtubule binding protein EB1 specifically targets the growing ends of microtubules in cells, where EB1 facilitates the interactions of cellular proteins with microtubule plus-ends. Microtubule end targeting of EB1 has been attributed to high affinity binding of EB1 to GTP-tubulin that is present at growing microtubule ends. However, our 3D single-molecule diffusion simulations predicted a ~6000% increase in EB1 arrivals to open, tapered microtubule tip structures relative to closed lattice conformations. Using quantitative fluorescence, single-molecule, and electron microscopy experiments, we found that the binding of EB1 onto opened, structurally disrupted microtubules was dramatically increased relative to closed, intact microtubules, regardless of hydrolysis state. Correspondingly, in cells, the conversion of growing microtubule ends from a tapered into a blunt configuration resulted in reduced EB1 targeting. Together, our results suggest that microtubule structural recognition, based on a fundamental diffusion-limited binding model, facilitates the tip tracking of EB1 at growing microtubule ends.

Abstract Intercellular communication is critical for the development of invasive cancers. Multiple forms of intercellular communication have been well characterized, involving diffusible soluble factors or contact-dependent channels for immediately adjacent cells. Over the past 1-2 decades, the emergence of a unique form of F-actin-based cellular protrusion known as tunneling nanotubes (TNTs) has filled the niche of long-range cell-contact dependent intercellular communication that facilitates cell growth, differentiation, and in the case of invasive cancer phenotypes, a more chemoresistant phenotype. The cellular machinery of TNT-mediated transport is an area of active investigation, and microtubules have been implicated in this process as they are in other membranous protrusions. Tumor-Treating Fields (TTFields) therapy is a novel therapeutic strategy in clinical use for patients with advanced cancers, based on the principle of using low-intensity alternating electric fields to disrupt microtubules in cancer cells undergoing mitosis. Other mechanisms of action have also been demonstrated. In this study, we investigated the effects of TTFields on TNTs in malignant pleural mesothelioma (MPM) in vitro and also on the spatial transcriptomic landscape in vivo . We found that applying TTFields at 1.0 V/cm significantly suppressed TNT formation in a biphasic MPM cell line (MSTO-211H), but not in sarcomatoid MPM (VAMT). At these parameters, TTFields significantly reduced cell count in MSTO-211H, but did not significantly alter intercellular transport of mitochondria via intact TNTs. To understand how TTFields may impact expression of genes with known involvement to TNT formation and overall tumor growth, we performed spatial genomic assessment of TTFields-treated tumors from an in vivo animal model of MPM, and detected upregulation of immuno-oncologic biomarkers with simultaneous downregulation of pathways associated with cell hyperproliferation, invasion, and other critical regulators of oncogenic growth. Several molecular classes and pathways coincide with markers that we and others have found to be differentially expressed in cancer cell TNTs, including MPM specifically. In this study, we report novel cellular and molecular effects of TTFields in relation to tumor communication networks enabled by TNTs and related molecular pathways. These results position TNTs as potential therapeutic targets for TTFields-directed cancer treatment strategies; and also identify the ability of TTFields to potentially remodel the tumor microenvironment, thus enhancing response to immunotherapeutic drugs.

Abstract Formins stimulate actin polymerization by promoting both filament nucleation and elongation. Because nucleation and elongation draw upon a common pool of actin monomers, the rate at which each reaction proceeds influences the other. This interdependent mechanism determines the number of filaments assembled over the course of a polymerization reaction, as well as their equilibrium lengths. In this study, we used kinetic modeling and in vitro polymerization reactions to dissect the contributions of filament nucleation and elongation to the process of formin-mediated actin assembly. We found that the rates of nucleation and elongation evolve over the course of a polymerization reaction. The period over which each process occurs is a key determinant of the total number of filaments that are assembled, as well as their average lengths at equilibrium. Inclusion of formin in polymerization reactions speeds filament nucleation, thus increasing the number and shortening the lengths of filaments that are assembled over the course of the reaction. Although variations in elongation rates produce modest changes in the equilibrium lengths of formin-bound filaments, nucleation constitutes the primary mode of monomer consumption over the course of assembly. Sustained elongation of small numbers of formin-bound filaments therefore requires inhibition of nucleation via monomer sequestration and a low concentration of activated formin. Our results underscore the mechanistic advantage for keeping formin’s nucleation efficiency relatively low in cells, where unregulated actin assembly would produce deleterious effects on cytoskeletal dynamics. Under these conditions, differences in the elongation rates mediated by formin isoforms are most likely to impact the kinetics of actin assembly.