Background. Since 2005, an increase in the prevalence of Clostridium difficile infection (CDI) due to polymerase chain reaction ribotype 078 has been noticed in The Netherlands. This strain has also been identified as the predominant strain in pigs and calves.

The expression of the Clostridium difficile binary toxin CDT is generally observed in the RT027 (ST1) and RT078 (ST11) C. difficile isolates, which are associated with severe C. difficile infection (CDI). However, we recently reported that the non-RT027 and non-RT078 C. difficile strain LC693 (TcdA+TcdB+ CDT+, ST201) caused severe diarrhea in a patient in Xiangya Hospital in China. C.difficile LC693 is a member of Clade 3, and in this study, we identified LC693 as RT871 and compared its virulence and pathogenicity to those of C.difficile R20291 (TcdA+TcdB+CDT+, ST1/RT027), UK6 (TcdA+TcdB+CDT+, ST35/RT027), CD630 (TcdA+TcdB+CDT-, ST54, RT012), and 1379 (TcdA+TcdB+CDT-, ST54/RT012), with strain 1379 being an epidemic C.difficile isolate from the same hospital. LC693 displayed a higher sporulation rate than R20291, CD630 or strain 1379. LC693 was comparable to R20291 with respect to spore germination, motility, and biofilm formation, but showed a faster germination rate, higher motility and a higher biofilm formation capability compared to CD630 and strain 1379. The adherence of spores to human gut epithelial cells was similar for all strains.The total toxin release of LC693 was lower than that of R20291, but higher than that of CD630 and strain 1379. Finally, in a mouse model of CDI, LC693 was capable of causing moderate to severe disease. Our findings demonstrate the pathogenicity of non-RT027 and non-RT078 binary toxin-positive C. difficile strains. Furthermore, our data indicate that LC693 may be more virulent than strain 1379, an epidemic strain from the same hospital, and provide the first phenotypic characterization of a non-RT027 and non-RT078 binary toxin-positive ST201 isolate.

ABSTRACT We report a patient case with pseudomembranous colitis associated with a mono-toxin producing Clostridioides difficile belonging to the very rarely diagnosed PCR ribotype (RT) 151. The infection was difficult to diagnose, since the isolate and the feces sample tested negative for toxin-encoding genes using a routine commercial test. This prompted us to sequence n = 11 RT151s from various geographical regions to study their genomic characteristics and relatedness. By including whole genome sequence data from other sources, we could further place these isolates into the phylogenetic tree of C. difficile and assign them to their respective clades. These analyses revealed that 1) RT151s are polyphyletic with isolates falling into clades 1, and cryptic clades C-I and C-II 2) RT151 contains both non-toxigenic and toxigenic isolates and 3) RT151 C-II isolates contained mono-toxin pathogenicity loci (PaLoc). Additional analysis with PacBio circular consensus sequencing revealed that the isolate from our patient case report contains a novel PaLoc insertion site, lacked tcdA and a had significantly divergent tcdB sequence that might explain the failure of the diagnostic test. The study is noteworthy as 1) RT151 encompasses both typical and cryptic clades and 2) conclusive evidence for CDI due to clade C-II isolates was hitherto lacking.

Abstract Until recently, metronidazole was the first-line treatment for Clostridioides difficile infection and it is still commonly used. Though resistance has been reported due to the plasmid pCD-METRO, this does not explain all cases. Here, we investigate resistance to metronidazole in a collection of clinical isolates of C. difficile . We find that nearly all isolates demonstrate a heme-dependent increase in the minimal inhibitory concentration for metronidazole, which in some cases leads to isolates being qualified as resistant (MIC > 2 mg/L). Moreover, whole genome sequence analysis reveals a single nucleotide polymorphism in the heme responsive gene hsmA , which defines a metronidazole resistant lineage of PCR ribotype 010 / multilocus sequence type 15 isolates that also includes pCD-METRO containing strains. Together our data demonstrate that heme is crucial for medium-dependent metronidazole resistance in C. difficile .

Abstract A subset of clinical isolates of Clostridioides difficile contains one or more plasmids and these plasmids can harbor virulence and antimicrobial resistance determinants. Despite their potential importance, C. difficile plasmids remain poorly characterized. Here, we describe a human clinical isolate that carries three plasmids from three different plasmid families that are therefore compatible. For two of these, we identify a region capable of sustaining plasmid replication in C. difficile . Together, our data advance our understanding of C. difficile plasmid biology. Highlights The complete circular genome sequence is provided for a C. difficile isolate harboring three plasmids These three plasmids (pJMR5-1, pJMR5-4 and pJRM5-W) are therefore compatible in a single strain Sequence analysis suggest a modular nature of plasmid families to which the pJMR-plasmids belong A functional replicon was cloned from pJMR5-1 (pCD-ECE1 family) and pJMR5-W (pCD-WTSI1 family) and plasmids carrying this replicon are compatible with plasmid pCD630

ABSTRACT Clostridioides difficile is the most common cause of antibiotic-associated gastrointestinal infections. Capillary-electrophoresis (CE)-PCR ribotyping is currently the gold standard for C. difficile typing but lacks discriminatory power to study transmission and outbreaks in detail. New molecular methods have the capacity to differentiate better, but backward compatibility with CE-PCR ribotyping must be assessed. Using a well-characterized collection of diverse strains (N=630; 100 unique ribotypes [RTs]), we aimed to investigate PCR ribotyping prediction from core genome multilocus sequence typing (cgMLST). Additionally, we compared the discriminatory power of cgMLST (SeqSphere & EnteroBase) and whole genome MLST (wgMLST) (EnteroBase) with single nucleotide polymorphism (SNP) analysis). A unique cgMLST profile (>6 allele differences) was observed in 82/100 ribotypes, indicating sufficient backward compatibility. Intra-RT allele difference varied per ribotype and MLST clade. Application of cg/wgMLST and SNP analysis in two outbreak settings with ribotypes RT078 and RT181 (known with a low intra-ribotype allele difference) showed no distinction between outbreak- and non-outbreak strains, in contrast to wgMLST and SNP analysis. We conclude that cgMLST has the potential to be an alternative to CE-PCR ribotyping. The method is reproducible, easy to standardize and offers higher discrimination. However, in some ribotype complexes adjusted cut-off thresholds and epidemiological data are necessary to recognize outbreaks. We propose to decrease the current threshold of 6 to 3 alleles to better identify outbreaks.

The aim was to highlight the incidence and epidemiology of

Clostridium difficile is a Gram-positive and sporulating enteropathogen that is a major cause of healthcare-associated infections. Even though a large number of genomes of this species have been sequenced, only a few plasmids have been described in the literature. Here, we use a combination of in silico analyses and laboratory experiments to show that plasmids are common in C. difficile. We focus on a group of plasmids that share similarity with the plasmid pCD630, from the reference strain 630. The family of pCD630-like plasmids is defined by the presence of a conserved putative helicase that is likely part of the plasmid replicon. This replicon is compatible with at least some other C. difficile replicons, as strains can carry pCD630-like plasmids in addition to other plasmids. We find two distinct sub-groups of pCD630-like plasmids that differ in size and accessory modules. This study is the first to describe a family of plasmids in C. difficile.

Background: Metronidazole is used to treat mild- to moderate Clostridioides difficile infections (CDI). No clear mechanism for metronidazole resistance has been described for C. difficile . A patient treated in the Leiden University Medical Center suffered from recurrent CDI caused by a PCR ribotype (RT) 020 strain which developed resistance to metronidazole (MIC = 8 mg/L). Resistance is also seen in animal isolates, predominantly of RT010. Methods: Six metronidazole susceptible and 12 metronidazole resistant isolates from human and animal origin, including the patient isolates, were analyzed by whole genome sequence (WGS) analysis. 585 susceptible and resistant isolates collected in various international studies were tested for the presence of plasmid by PCR. Plasmid copy number was determined by quantitative PCR. Findings: Stable metronidazole resistance correlated with the presence of a 7kb plasmid, pCD-METRO. pCD-METRO was not detected in 562 susceptible isolates, but was found in toxigenic and non-toxigenic metronidazole resistant strains from multiple countries (n=22). The introduction of a pCD-METRO-derived vector into a susceptible strain led to a ~25 fold increase in the metronidazole MIC. The pCD-METRO replicon sustained a plasmid copy number of ~30, which is higher than currently known replicons for C. difficile . Interpretation: We describe the first plasmid-mediated resistance to a clinically relevant antibiotic in C. difficile . pCD-METRO is an internationally disseminated plasmid capable of conferring metronidazole resistance in C. difficile , including epidemic ribotypes. Our finding that pCD-METRO may be mobilizable can impact diagnostics and treatment of CDI.