There is currently a clear benefit for many countries to utilize wastewater-based epidemiology (WBE) as part of ongoing measures to manage the coronavirus disease 2019 (COVID-19) global pandemic. Since most wastewater virus concentration methods were developed and validated for nonenveloped viruses, it is imperative to determine the efficiency of the most commonly used methods for the enveloped severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Municipal wastewater seeded with a human coronavirus (CoV) surrogate, murine hepatitis virus (MHV), was used to test the efficiency of seven wastewater virus concentration methods: (A–C) adsorption-extraction with three different pre-treatment options, (D–E) centrifugal filter device methods with two different devices, (F) polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation, and (G) ultracentrifugation. MHV was quantified by reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction and the recovery efficiency was calculated for each method. The mean MHV recoveries ranged from 26.7 to 65.7%. The most efficient methods were adsorption-extraction methods with MgCl2 pre-treatment (Method C), and without pre-treatment (Method B). The third most efficient method used the Amicon® Ultra-15 centrifugal filter device (Method D) and its recovery efficiency was not statistically different from the most efficient methods. The methods with the worst recovery efficiency included the adsorption-extraction method with acidification (A), followed by PEG precipitation (F). Our results suggest that absorption-extraction methods with minimal or without pre-treatment can provide suitably rapid, cost-effective and relatively straightforward recovery of enveloped viruses in wastewater. The MHV is a promising process control for SARS-CoV-2 surveillance and can be used as a quality control measure to support community-level epidemic mitigation and risk assessment.

ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVViewpointNEXTWastewater-Based Epidemiology: Global Collaborative to Maximize Contributions in the Fight Against COVID-19Aaron BivinsAaron BivinsDepartment of Civil and Environmental Engineering and Earth Sciences, University of Notre Dame, 156 Fitzpatrick Hall, Notre Dame, Indiana 46556, United StatesMore by Aaron Bivins, Devin NorthDevin NorthDepartment of Civil and Environmental Engineering and Earth Sciences, University of Notre Dame, 156 Fitzpatrick Hall, Notre Dame, Indiana 46556, United StatesMore by Devin North, Arslan AhmadArslan AhmadDepartment of Sustainable Development, Environmental Science and Engineering, KTH Royal Institute of Technology, Teknikringen 10B, SE-10044 Stockholm, SwedenKWR Water Research Institute, Groningenhaven 7 3433 PE Nieuwegein, The NetherlandsMore by Arslan Ahmad, Warish AhmedWarish AhmedCSIRO Land and Water, Ecosciences Precinct, 41 Boggo Road, Dutton Park, Queensland 4102, AustraliaMore by Warish Ahmed, Eric AlmEric AlmDepartment of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 21 Ames St, Cambridge, Massachusetts 02142, United StatesMore by Eric Alm, Frederic BeenFrederic BeenKWR Water Research Institute, Water Quality and Heath, Groningenhaven 7 3433 PE Nieuwegein, The NetherlandsMore by Frederic Been, Prosun BhattacharyaProsun BhattacharyaDepartment of Sustainable Development, Environmental Science and Engineering, KTH Royal Institute of Technology, Teknikringen 10B, SE-10044 Stockholm, SwedenKWR Water Research Institute, Groningenhaven 7 3433 PE Nieuwegein, The NetherlandsMore by Prosun Bhattacharyahttp://orcid.org/0000-0003-4350-9950, Lubertus BijlsmaLubertus BijlsmaAnalytical Chemistry in Public Health and the Environment, University Jaume I, Av. Vicent Sos Baynat, s/n 12071 Castellón de la Plana, SpainMore by Lubertus Bijlsmahttp://orcid.org/0000-0001-7005-8775, Alexandria B. BoehmAlexandria B. BoehmDepartment of Civil and Environmental Engineering, Stanford University, 473 Via Ortega, Stanford, California 94305, United StatesMore by Alexandria B. Boehm, Joe BrownJoe BrownSchool of Civil and Environmental Engineering, Georgia Institute of Technology, 311 Ferst Drive, Atlanta, Georgia 30332, United StatesMore by Joe Brownhttp://orcid.org/0000-0002-5200-4148, Gianluigi ButtiglieriGianluigi ButtiglieriCatalan Institute for Water Research (ICRA), Emili Grahit 101, E-17003 Girona, SpainMore by Gianluigi Buttiglieri, Vincenza CalabroVincenza CalabroLaboratory of Transport Phenomena & Biotechnology, Department of Computer Engineering, Modeling, Electronics and Systems, University of Calabria, Via P. Bucci, Cubo 42/a 87036 Rende, Cosenza, ItalyMore by Vincenza Calabro, Annalaura CarducciAnnalaura CarducciDepartment of Biology, University of Pisa, Via Volta 4 bis, 13 56126 Pisa, ItalyMore by Annalaura Carducci, Sara CastiglioniSara CastiglioniDepartment of Environmental Health Sciences, Instituto di Richerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, Via Mario Negri, 2, 20156 Milan, ItalyMore by Sara Castiglioni, Zeynep Cetecioglu GurolZeynep Cetecioglu GurolDepartment of Chemical Engineering, KTH Royal Institute of Technology, Teknikringen 42, SE-11428 Stockholm, SwedenMore by Zeynep Cetecioglu Gurol, Sudip ChakrabortySudip ChakrabortyLaboratory of Transport Phenomena & Biotechnology, Department of Computer Engineering, Modeling, Electronics and Systems, University of Calabria, Via P. Bucci, Cubo 42/a 87036 Rende, Cosenza, ItalyMore by Sudip Chakraborty, Federico CostaFederico CostaInstituto de Saúde Coletiva, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brazil. 40110-040More by Federico Costa, Stefano CurcioStefano CurcioLaboratory of Transport Phenomena & Biotechnology, Department of Computer Engineering, Modeling, Electronics and Systems, University of Calabria, Via P. Bucci, Cubo 42/a 87036 Rende, Cosenza, ItalyMore by Stefano Curcio, Francis L. de los Reyes IIIFrancis L. de los Reyes, IIIDepartment of Civil, Construction, and Environmental Engineering, North Carolina State University, 2501 Stinson Dr, Raleigh, North Carolina 27607, United StatesMore by Francis L. de los Reyes, IIIhttp://orcid.org/0000-0002-3593-0932, Jeseth Delgado VelaJeseth Delgado VelaDepartment of Civil and Environmental Engineering, Howard University, 2300 Sixth Street, NW #1026, Washington, D.C. 20059, United StatesMore by Jeseth Delgado Velahttp://orcid.org/0000-0001-6171-4400, Kata FarkasKata FarkasSchool of Ocean Sciences, Bangor University, Menai Bridge, Anglesey, LL59 5AB, U.K.More by Kata Farkas, Xavier Fernandez-CasiXavier Fernandez-CasiLaboratory of Environmental Chemistry, School of Architecture, Civil and Environmental Engineering (ENAC), École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), CH-1015, Lausanne, SwitzerlandMore by Xavier Fernandez-Casi, Charles GerbaCharles GerbaDepartment of Environmental Science, University of Arizona, 2959 W Calle Agua Nueva, Tucson, Arizona 85745, United StatesMore by Charles Gerba, Daniel GerrityDaniel GerrityApplied Research and Development Center, Southern Nevada Water Authority, 100 S City Pkwy Suite 700, Las Vegas, Nevada 89106, United StatesMore by Daniel Gerrity, Rosina GironesRosina GironesDepartment of Genetics, Microbiology and Statistics, University of Barcelona, Diagonal, 643 08028 Barcelona, SpainMore by Rosina Girones, Raul GonzalezRaul GonzalezHampton Roads Sanitation District, 1434 Air Rail Ave, Virginia Beach, Virginia 23455, United StatesMore by Raul Gonzalezhttp://orcid.org/0000-0002-8115-7709, Eiji HaramotoEiji HaramotoInterdisciplinary Center for River Basin Environment, University of Yamanashi, 4-3-11 Takeda, Kofu, Yamanashi 400-8511, JapanMore by Eiji Haramotohttp://orcid.org/0000-0002-0126-0651, Angela HarrisAngela HarrisDepartment of Civil, Construction, and Environmental Engineering, North Carolina State University, 2501 Stinson Dr, Raleigh, North Carolina 27607, United StatesMore by Angela Harris, Patricia A. HoldenPatricia A. HoldenBren School of Environmental Science & Management, University of California, 3508 Bren Hall, Santa Barbara, California 93106, United StatesMore by Patricia A. Holdenhttp://orcid.org/0000-0002-6777-5359, Md. Tahmidul IslamMd. Tahmidul IslamDepartment of Sustainable Development, Environmental Science and Engineering, KTH Royal Institute of Technology, Teknikringen 10B, SE-10044 Stockholm, SwedenMore by Md. Tahmidul Islam, Davey L. JonesDavey L. JonesSchool of Natural Sciences, Bangor University, Gwynedd, Wales LL57 2UW, United KingdomMore by Davey L. Jones, Barbara Kasprzyk-HordernBarbara Kasprzyk-HordernDepartment of Chemistry, University of Bath, Claverton Down Bath, BA2 7AY, United KingdomMore by Barbara Kasprzyk-Hordernhttp://orcid.org/0000-0002-6809-2875, Masaaki KitajimaMasaaki KitajimaDivision of Environmental Engineering, Hokkaido University, North 13 West 8, Kita-ku, Sapporo, Hokkaido 060-8628, JapanMore by Masaaki Kitajimahttp://orcid.org/0000-0002-8142-511X, Nadine KotlarzNadine KotlarzDepartment of Biological Sciences, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina 27695, United StatesMore by Nadine Kotlarzhttp://orcid.org/0000-0002-7302-9176, Manish KumarManish KumarDiscipline of Earth Science, Indian Institute of Technology, Gandhinagar, Gujarat 382 355, IndiaMore by Manish Kumarhttp://orcid.org/0000-0002-3351-7298, Keisuke KurodaKeisuke KurodaDepartment of Environmental & Civil Engineering, Toyama Prefectural University, 5180 Kurokawa, Imizu-city, Toyama 9390398 JapanMore by Keisuke Kuroda, Giuseppina La RosaGiuseppina La RosaDepartment of Environment and Health, Italian National Institute of Health, Viale Regina Elena, 299, 00161, Roma RM, ItalyMore by Giuseppina La Rosa, Francesca MalpeiFrancesca MalpeiDipartimento di Ingegneria Civile e Ambientale, Politecnico di Milano, Piazza Leonardo da Vinci, 32, 20133 Milano MI, ItalyMore by Francesca Malpei, Mariana MautusMariana MautusBiobot Analytics, LLC, Somerville, Massachusetts 02143, United StatesMore by Mariana Mautushttp://orcid.org/0000-0002-2880-0339, Sandra L. McLellanSandra L. McLellanSchool of Freshwater Sciences, University of Wisconsin-Milwaukee, 600 E Greenfield Ave, Milwaukee, Wisconsin 53204, United StatesMore by Sandra L. McLellanhttp://orcid.org/0000-0003-3283-1151, Gertjan MedemaGertjan MedemaKWR Water Research Institute, Water Quality and Heath, Groningenhaven 7 3433 PE Nieuwegein, The NetherlandsDelft University of Technology, Stevinweg 1, 2628 CN Delft, The NetherlandsMichigan State University, Natural Resources, 1405 S Harrison Rd, East Lansing, Michigan 48823, United StatesMore by Gertjan Medemahttp://orcid.org/0000-0003-0475-6465, John Scott MeschkeJohn Scott MeschkeDept. Environmental and Occupational Health Sciences, School of Public Health, University of Washington, Seattle Washington 98105-6099, United StatesMore by John Scott Meschke, Jochen MuellerJochen MuellerQueensland Alliance for Environmental Health Sciences (QAEHS), University of Queensland, 20 Cornwall Street, Brisbane, Queensland 4102 AustraliaMore by Jochen Mueller, Ryan J. NewtonRyan J. NewtonSchool of Freshwater Sciences, University of Wisconsin-Milwaukee, 600 E Greenfield Ave, Milwaukee, Wisconsin 53204, United StatesMore by Ryan J. Newtonhttp://orcid.org/0000-0001-8946-0035, David NilssonDavid NilssonDepartment of Sustainable Development, Environmental Science and Engineering, KTH Royal Institute of Technology, Teknikringen 10B, SE-10044 Stockholm, SwedenMore by David Nilsson, Rachel T. NobleRachel T. NobleUNC Chapel Hill Institute of Marine Sciences, Morehead City, North Carolina 28557, United StatesMore by Rachel T. Noble, Alexander van NuijsAlexander van NuijsToxicological Centre, University of Antwerp, Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk, BelgiëMore by Alexander van Nuijs, Jordan PecciaJordan PecciaDepartment of Chemical and Environmental Engineering, Yale University, 17 Hillhouse Avenue, New Haven, Connecticut 06520-8292, United StatesMore by Jordan Pecciahttp://orcid.org/0000-0002-6482-2084, T. Alex PerkinsT. Alex PerkinsDepartment of Biological Sciences and Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, Notre Dame, Indiana 46556, United StatesMore by T. Alex Perkins, Amy J. PickeringAmy J. PickeringCivil and Environmental Engineering, Tufts University, Medford, Massachusetts 02155, United StatesMore by Amy J. Pickeringhttp://orcid.org/0000-0001-6193-2221, Joan RoseJoan RoseDepartment of Fisheries and Wildlife, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824, United StatesMore by Joan Rose, Gloria SanchezGloria SanchezInstitute of Agrochemistry and Food Technology (IATA-CSIC), Catedratico Agustin Escardino Benlloch, 7 46980 Paterna − Valencia, SpainMore by Gloria Sanchez, Adam SmithAdam SmithAstani Department of Civil and Environmental Engineering, University of Southern California, 3620 S Vermont Ave, Los Angeles, California 90089, United StatesMore by Adam Smithhttp://orcid.org/0000-0002-3964-7544, Lauren StadlerLauren StadlerDepartment of Civil and Environmental Engineering, Rice University, 6100 Main St, Houston, Texas 77005, United StatesMore by Lauren Stadlerhttp://orcid.org/0000-0001-7469-1981, Christine StauberChristine StauberSchool of Public Health, Georgia State University, 100 Piedmont Avenue, NE Atlanta, Georgia 30302, United StatesMore by Christine Stauber, Kevin ThomasKevin ThomasQueensland Alliance for Environmental Health Sciences (QAEHS), University of Queensland, 20 Cornwall Street, Brisbane, Queensland 4102 AustraliaMore by Kevin Thomashttp://orcid.org/0000-0002-2155-100X, Tom van der VoornTom van der VoornInstitute of Environmental Systems Research, University of Osnabrück, Barbarastr. 12, D49069, Osnabrück, GermanyMore by Tom van der Voorn, Krista WiggintonKrista WiggintonDepartment of Civil and Environmental Engineering, University of Michigan, 1351 Beal Avenue, EWRE 181 Ann Arbor, Michigan 48109-2125, United StatesMore by Krista Wiggintonhttp://orcid.org/0000-0001-6665-5112, Kevin ZhuKevin ZhuSchool of Civil and Environmental Engineering, Georgia Institute of Technology, 311 Ferst Drive, Atlanta, Georgia 30332, United StatesMore by Kevin Zhu, and Kyle Bibby*Kyle BibbyDepartment of Civil and Environmental Engineering and Earth Sciences, University of Notre Dame, 156 Fitzpatrick Hall, Notre Dame, Indiana 46556, United States*Email: [email protected]More by Kyle Bibbyhttp://orcid.org/0000-0003-3142-6090Cite this: Environ. Sci. Technol. 2020, 54, 13, 7754–7757Publication Date (Web):June 12, 2020Publication History Received16 April 2020Published online12 June 2020Published inissue 7 July 2020https://doi.org/10.1021/acs.est.0c02388Copyright © 2020 American Chemical SocietyRequest reuse permissions This publication is Open Access under the license indicated. Learn MoreArticle Views28086Altmetric-Citations257LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail PDF (2 MB) Get e-AlertscloseSUBJECTS:COVID-19,Genetics,Immunology,Infectious diseases,SARS-CoV-2,Sewage,Wastewater Get e-Alerts

It is well established that air travel plays a key role in the global spread of many enteric and respiratory diseases, including COVID-19. Even with travel restrictions (e.g. mask wearing, negative COVID-19 test prior to departure), SARS-CoV-2 may be transmitted by asymptomatic or pre-symptomatic individuals carrying the virus. Due to the limitation of current clinical surveillance approaches, complementary methods need to be developed to allow estimation of the frequency of SARS-CoV-2 entry across international borders. Wastewater-based epidemiology (WBE) represents one such approach, allowing the unbiased sampling of SARS-CoV-2 carriage by passenger cohorts entering via airports. In this study, we monitored sewage in samples from terminals (n = 150) and aircraft (n = 32) at three major international airports in the UK for 1-3 weeks in March 2022. As the raw samples were more turbid than typical municipal wastewater, we used beef extract treatment followed by polyethylene glycol (PEG) precipitation to concentrate viruses, followed by reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) for the detection of SARS-CoV-2 and a faecal indicator virus, crAssphage. All samples taken from sewers at the arrival terminals of Heathrow and Bristol airports, and 85% of samples taken from sites at Edinburgh airport, were positive for SARS-CoV-2. This suggests a high COVID-19 prevalence among passengers and/or airport staff members. Samples derived from aircraft also showed 93% SARS-CoV-2 positivity. No difference in viral prevalence was found before and after COVID-19 travel restrictions were lifted. Our results suggest that WBE is a useful tool for monitoring the global transfer rate of human pathogens and other disease-causing agents across international borders and should form part of wider international efforts to monitor and contain the spread of future disease outbreaks.

Wastewater serves as an important reservoir of antimicrobial resistance (AMR), and its surveillance can provide insights into population-level trends in AMR to inform public health policy. This study compared two common high-throughput screening approaches, namely (i) high-throughput quantitative PCR (HT qPCR), targeting 73 antimicrobial resistance genes, and (ii) metagenomic sequencing. Weekly composite samples of wastewater influent were taken from 47 wastewater treatment plants (WWTPs) across Wales, as part of a national AMR surveillance programme, alongside 4 weeks of daily wastewater effluent samples from a large municipal hospital. Metagenomic analysis provided more comprehensive resistome coverage, detecting 545 genes compared to the targeted 73 genes by HT qPCR. It further provided contextual information critical to risk assessment (i.e. potential bacterial hosts). In contrast, HT qPCR exhibited higher sensitivity, quantifying all targeted genes including those of clinical relevance present at low abundance. When limited to the HT qPCR target genes, both methods were able to reflect the spatiotemporal dynamics of the complete metagenomic resistome, distinguishing that of the hospital and the WWTPs. Both approaches revealed correlations between resistome compositional shifts and environmental variables like ammonium wastewater concentration, though differed in their interpretation of some potential influencing factors. Overall, metagenomics provides more comprehensive resistome profiling, while qPCR permits sensitive quantification of genes significant to clinical resistance. We highlight the importance of selecting appropriate methodologies aligned to surveillance aims to guide the development of effective wastewater-based AMR monitoring programmes.

Wastewater-based monitoring has been widely implemented worldwide for the tracking of SARS-CoV-2 outbreaks and other viral diseases. In many surveillance programmes, unprocessed and processed wastewater samples are often frozen and stored for long periods of time in case the identification and tracing of an emerging health threat becomes necessary. However, extensive sample bioarchives may be difficult to maintain due to limitations in ultra-freezer capacity and associated cost. Furthermore, the stability of viruses in such samples has not been systematically investigated and hence the usefulness of bioarchives is unknown. In this study, we assessed the stability of SARS-CoV-2, influenza viruses, noroviruses and the faecal indicator virus, crAssphage, in raw wastewater and purified nucleic aacid extracts stored at -80 °C for 6-24 months. We found that the isolated viral RNA and DNA showed little signs of degradation in storage over 8-24 months, whereas extensive decay viral and loss of qPCR signal was observed during the storage of raw unprocessed wastewater. The most stable viruses were noroviruses and crAssphage, followed by SARS-CoV-2 and influenza A virus. Based on our findings, we conclude that bioarchives comprised of nucleic acid extracts derived from concentrated wastewater samples may be archived long-term, for at least two years, whereas raw wastewater samples may be discarded after one year.

Detection of viruses in the environment is heavily dependent on PCR-based approaches that require reference sequences for primer design. While this strategy can accurately detect known viruses, it will not find novel genotypes, nor emerging and invasive viral species. In this study, we investigated the use of viromics, i.e. high-throughput sequencing of the biosphere viral fraction, to detect human/animal pathogenic RNA viruses in the Conwy river catchment area in Wales, UK. Using a combination of filtering and nuclease treatment, we extracted the viral fraction from wastewater, estuarine river water and sediment, followed by RNASeq analysis on the Illumina HiSeq platform for the discovery of RNA virus genomes. We found a higher richness of RNA viruses in wastewater samples than in river water and sediment, and assembled a complete norovirus GI.2 genome from wastewater effluent, which was not contemporaneously detected by conventional qRT-PCR. To our knowledge, this is the first environmentally-derived norovirus genome sequence to be available from a public database. The simultaneous presence of diverse rotavirus signatures in wastewater indicated the potential for zoonotic infections in the area and suggested run-off from pig farms as a possible origin of these viruses. Our results show that viromics can be an important tool in the discovery of pathogenic viruses in the environment and can be used to inform and optimize reference-based detection methods provided appropriate and rigorous controls are included.

Sustainability of bivalve shellfish farming relies on clean coastal waters, however, high levels of faecal indicator organisms (FIOs, e.g. Escherichia coli) in shellfish results in temporary closure of shellfish harvesting beds to protect human health, but with economic consequences for the shellfish industry. Active Management Systems which can predict FIO contamination may help reduce shellfishery closures. This study evaluated predictors of E. coli concentrations in two shellfish species, the blue mussel (Mytilus edulis) and the Pacific oyster (Crassostrea gigas), at different spatial and temporal scales, within 12 estuaries in England and Wales. We aimed to: (i) identify consistent catchment-scale or within-estuary predictors of elevated E. coli levels in shellfish, (ii) evaluate whether high river flows associated with rainfall events were a significant predictor of shellfish E. coli concentrations, and the time lag between these events and E. coli accumulation, and (iii) whether operation of Combined Sewer Overflows (CSO) is associated with higher E. coli concentrations in shellfish. A cross-catchment analysis gave a good predictive model for contamination management (R

Abstract The accurate detection and quantification of pathogenic viruses in water is essential to understand and reduce the risk of human infection. This paper describes a two-step method suitable for the concentration of viruses in water and wastewater samples. The method involves a tangential flow ultrafiltration step that reduces the sample volume of 1-10 l to approx. 50 ml, followed by secondary precipitation using polyethylene glycol 6000 that reduces the volume to 1-4 ml. For method validation, water samples were spiked with different concentrations of enteric viruses and viral recoveries in the concentrates exceeded 10% in all experiments. The method is suitable for water samples with high and low salinity and turbidity, allowing the accurate comparison of viral titers in a diverse range of water types. Furthermore, the method has the potential to concentrate other pathogens, e.g. bacteria or protozoa. Hence, the use of this method can improve the holistic assessment of risks associated with wastewater-contaminated environments.

Abstract Capsid Integrity qPCR (CI-qPCR) assays offer a promising alternative to cell culture-based infectivity assays for assessing pathogenic human virus viability in wastewater. This study compared three CI-qPCR methods: two novel (Crosslinker, TruTiter) and one established (PMAxx dye). These methods were evaluated on heat-inactivated and non-heat-inactivated ‘live’ viruses spiked into phosphate-buffered saline ( PBS) and wastewater, as well as on viruses naturally present in wastewater samples. The viral panel included Human adenovirus 5 (HAdV), enterovirus A71 (EV), hepatitis-A virus (HAV), influenza-A H3N2 (IAV), respiratory syncytial virus A2 (RSV), norovirus GI, norovirus GII, and SARS-CoV-2. All three methods successfully differentiated between degraded, heat-inactivated, and live viruses in PBS. While all three methods were comparable for HAdV and norovirus GI, PMAxx detected significantly lower gene copies for EV and IAV. In spiked wastewater, PMAxx yielded significantly lower gene copies for all heat-inactivated viruses (HAdV, EV, HAV, IAV, and RSV) compared to the Crosslinker and TruTiter methods. For viruses naturally present in wastewater (un-spiked), no significant difference was observed between PMAxx and TruTiter methods. Intact, potentially infectious viruses were detected using both PMAxx and TruTiter on untreated and treated wastewater samples. A comparative analysis of qPCR data and TEM images revealed that viral flocculation of IAV may interfere with capsid integrity assays using intercalating dyes. In summary, our findings not only advance the development of more effective methods for assessing viral viability in wastewater, but also highlight the potential of CI-qPCR techniques to enhance early warning systems for emerging pathogens, thereby strengthening public health preparedness and response strategies.

Wastewater-based epidemiology (WBE) has been demonstrably successful as a relatively unbiased tool for monitoring levels of SARS-CoV-2 virus circulating in communities during the COVID-19 pandemic. Accumulated biobanks of wastewater samples allow retrospective exploration of spatial and temporal trends for public health indicators such as chemicals, viruses, antimicrobial resistance genes, and the possible emergence of novel human or zoonotic pathogens. We investigated virus resilience to time, temperature, and freeze-thaw cycles, plus the optimal storage conditions to maintain the stability of genetic material (RNA/DNA) of viral +ssRNA (Envelope – E, Nucleocapsid – N and Spike protein – S genes of SARS-CoV-2), dsRNA (Phi6 phage) and circular dsDNA (crAssphage) in wastewater. Samples consisted of (i) processed and extracted wastewater samples, (ii) processed and extracted distilled water samples, and (iii) raw, unprocessed wastewater samples. Samples were stored at -80°C, -20°C, 4°C, or 20°C for 10 days, going through up to 10 freeze-thaw cycles (once per day). Sample stability was measured using reverse transcription quantitative PCR, quantitative PCR, automated electrophoresis, and short-read whole genome sequencing. Exploring different areas of the SARS-CoV-2 genome demonstrated that the S gene in processed and extracted samples showed greater sensitivity to freeze-thaw cycles than the E or N genes. Investigating surrogate and normalisation viruses showed that Phi6 remains a stable comparison for SARS-CoV-2 in a laboratory setting and crAssphage was relatively resilient to temperature variation. Recovery of SARS-CoV-2 in raw unprocessed samples was significantly greater when stored at 4°C, which was supported by the sequencing data for all viruses – both time and freeze-thaw cycles negatively impacted sequencing metrics. Historical extracts stored at -80°C that were re-quantified 12, 14 and 16 months after original quantification showed no major changes. This study highlights the importance of the fast processing and extraction of wastewater samples, following which viruses are relatively robust to storage at a range of temperatures.