Sensory hair cells in the ear utilize specialized ribbon synapses. These synapses are defined by electron-dense presynaptic structures called ribbons, composed primarily of the structural protein Ribeye. Previous work has shown that voltage-gated influx of Ca2+ through CaV1.3 channels is critical for hair-cell synapse function and can impede ribbon formation. We show that in mature zebrafish hair cells, evoked-presynaptic Ca2+ influx through CaV1.3 channels initiates mitochondrial Ca2+ (mito-Ca2+) uptake adjacent to ribbons. Block of mito-Ca2+ uptake in mature cells depresses presynaptic Ca2+ influx and impacts synapse integrity. In developing zebrafish hair cells, mito-Ca2+ uptake coincides with spontaneous rises in presynaptic Ca2+ influx. Spontaneous mito-Ca2+ loading lowers cellular NAD+/NADH redox and downregulates ribbon formation. Direct application of NAD+ or NADH increases or decreases ribbon formation respectively, possibly acting through the NAD(H)-binding domain on Ribeye. Our results present a mechanism where presynaptic- and mito-Ca2+ couple to confer proper presynaptic function and formation.

Summary Axon terminal structure is critical for neuronal function. This cellular compartment houses synaptic terminals and is a site of high metabolic and functional demand. Axon terminals are also the site of a change in microtubule structure within the neuron. Microtubule stability is decreased relative to the axon shaft due to an enrichment of microtubule plus ends and increase in microtubule dynamics. These dynamic microtubule plus ends have many functions including serving as a docking site for the microtubule motor protein complex Cytoplasmic dynein. Here, we report an unexplored function of the dynein motor in axon terminals: regulation of microtubule stability. Using a forward genetic screen, we identified a mutant with abnormal axon terminal structure due to a loss of function mutation in the dynein interacting protein NudC. We show that the primary function of NudC in the axon terminal is as a chaperone for the protein Lis1. Loss of NudC results in decreased Lis1 protein in this neuronal compartment. Decreased Lis1 in nudc mutants causes dynein/dynactin accumulation and increased microtubule stability in axon terminals. Microtubules in the proximal axon are unaffected. Abnormal microtubule stability and structure can be suppressed by pharmacologically inhibiting dynein, implicating excess dynein motor activity as causal in the enhanced axon terminal microtubule stability. Together, our data support a model in which local NudC-Lis1 modulation of dynein motor activity is critical for regulation of microtubule stability in the axon terminal.

Dendritic spines are signaling microcompartments that serve as the primary site of synapse formation in neurons. Actin assembly and myosin 2 contractility play major roles in the maturation of spines from filopodial precursors, as well as in the subsequent, activity-dependent changes in spine morphology that underly learning and memory. Myosin 18A is a myosin 2-like protein conserved from flies to man that lacks motor activity, is sub-stochiometric to myosin 2, and co-assembles with myosin 2 to make mixed filaments. Myosin 18A is alternatively spliced to create multiple isoforms that contain unique N- and C-terminal extensions harboring both recognizable and uncharacterized protein: protein interaction domains. These observations suggest that myosin 18A serves to recruit proteins to mixed filaments of myosin 2 and myosin 18A. One protein known to bind to myosin 18A is β-Pix, a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for Rac1 and Cdc42. Notably, β-Pix has been shown to promote spine maturation by activating both Arp2/3 complex-dependent branched actin filament assembly and myosin 2 contractility within spines. Here we show that myosin 18Aα is expressed in cerebellar Purkinje neurons and concentrates in spines along with myosin 2 and F-actin. Myosin 18Aα is targeted to spines by co-assembling with myosin 2 and by an actin binding site present in its N-terminal extension. miRNA-mediated knockdown of myosin 18Aα results in a significant defect in spine maturation that is rescued by an RNAi-immune version of myosin 18Aα. Importantly, β-Pix co-localizes with myosin 18Aα in spines, and its spine localization is lost upon myosin 18A&α knockdown or when its myosin 18Aα binding site is deleted. Finally, we show that the spines of myosin 18Aα knockdown Purkinje neurons contain significantly less F-actin and myosin 2. Together, these data demonstrate that mixed filaments of myosin 2 and myosin 18Aα form a complex with β-Pix in Purkinje neuron spines that promotes spine maturation by enhancing the assembly of actin and myosin filaments downstream of β-Pixs GEF activity.

SUMMARY The transient K + current (I A ) carried by pore forming Kv4.2 subunits regulates the propagation of synaptic input, dendritic excitability, and synaptic plasticity in CA1 pyramidal neuron dendrites of the hippocampus. We report that the Ca 2+ channel subunit Cav2.3 regulates I A in this cell type. We first identified Cav2.3 as a Kv4.2 interacting protein in a proteomic screen and we confirmed Cav2.3-Kv4.2 complex association using multiple techniques. Functionally, Cav2.3 Ca 2+ -entry increases Kv4.2-mediated whole-cell current due to an increase in Kv4.2 surface expression. Using pharmacology and Cav2.3 knockout mice, Cav2.3 was found to promote whole-cell I A and the increasing gradient of I A in the apical dendrite distal to the neuronal soma. Furthermore, the loss of Cav2.3 function leads to enhancement of synaptic currents and spine Ca 2+ influx. These results present Cav2.3 and Kv4.2 as integral constituents of an ion channel complex that impacts synaptic function in the hippocampus.