Following immune attack, solid tumors upregulate coinhibitory ligands that bind to inhibitory receptors on T cells. This adaptive resistance compromises the efficacy of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies, which redirect T cells to solid tumors. Here, we investigated whether programmed death-1-mediated (PD-1-mediated) T cell exhaustion affects mesothelin-targeted CAR T cells and explored cell-intrinsic strategies to overcome inhibition of CAR T cells. Using an orthotopic mouse model of pleural mesothelioma, we determined that relatively high doses of both CD28- and 4-1BB-based second-generation CAR T cells achieved tumor eradication. CAR-mediated CD28 and 4-1BB costimulation resulted in similar levels of T cell persistence in animals treated with low T cell doses; however, PD-1 upregulation within the tumor microenvironment inhibited T cell function. At lower doses, 4-1BB CAR T cells retained their cytotoxic and cytokine secretion functions longer than CD28 CAR T cells. The prolonged function of 4-1BB CAR T cells correlated with improved survival. PD-1/PD-1 ligand [PD-L1] pathway interference, through PD-1 antibody checkpoint blockade, cell-intrinsic PD-1 shRNA blockade, or a PD-1 dominant negative receptor, restored the effector function of CD28 CAR T cells. These findings provide mechanistic insights into human CAR T cell exhaustion in solid tumors and suggest that PD-1/PD-L1 blockade may be an effective strategy for improving the potency of CAR T cell therapies.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors that threaten human health; thus, the establishment of an animal model with clinical features similar to human liver cancer is of important practical significance. Taking advantage of the novel microcarrier-6, human HCC cells was injected into immunocompetent mice to establish a novel human HCC patient-derived xenograft (PDX) model. Primary HCC cells were isolated from fresh liver cancer tissues, which were subsequently co-cultured with microcarrier-6 to construct a three-dimensional tumor cell culture model in vitro. The HCC-microcarrier complex was implanted into mice by subcutaneous inoculation, and the tumor formation time, tumor formation rate, and pathological manifestation were recorded. Changes of immune parameters in mice were detected by flow cytometry. The success rate was 60% (6/10) in the establishment of liver cancer PDX mouse model，and the total tumor formation rate of the tumor-forming model is 90-100%. H&E staining and immunohistochemical experiments indicate that the model well retained the characteristics of the primary tumor. Interestingly, M2 macrophages in tumor-bearing mice increased significantly, and the levels of CD4+ T cells were significantly reduced. Through the application of the microcarrier-6 in immunocompetent mice, we successfully established a novel human HCC PDX model, which can be used to better study and further elucidate the occurrence and pathogenic mechanism of HCC.

Collagen-induced arthritis (CIA) mouse model is currently the most widely used and reliable autoimmune model to study rheumatoid arthritis. In this model, we used bovine type II collagen (CII) and complete Freund’s adjuvant (CFA) or incomplete Freund’s adjuvant (IFA) to form emulsifier, and mice were injected intradermal to induce autoimmune arthritis (CIA). In this model, we ground bovine collagen type II (CII) with complete Freund’s adjuvant (CFA) or incomplete Freund’s adjuvant (IFA) to form emulsifiers, and intradermal injection in mice induced autoimmune arthritis (CIA). This article describes the mouse, CFA strains, key emulsification, anesthesia, and injection immune techniques, as well as the incidence, date of onset, score, pathological results of arthritis. The total time for preparation of reagents and immunization of 20 mice was about 2-2.5 hours. In this protocol, we induced a high incidence of CIA with DBA/1J in genetically susceptible mice and assessed the severity and pathology of the disease, at the same time we found that CII also can induced enteritis, including ileitis and colitis. The initial symptoms of arthritis appear in the 24-26 days of the experiment, that is, 3-5 days after the second immunization, the peak period of inflammation was 30-36 days, the arthritis incidence about 90-100%, at the same time, the incidence of enteritis and arthritis were the same, small intestinal inflammation was more severe, but the duration was short; while the colonic inflammation was mild, and the duration was longer than enteritis, we named it collagen induced inflammations (CIIs).

ABSTRACT Clonal hematopoiesis (CH) is defined as clonal expansion of mutant hematopoietic stem cells absent diagnosis of a hematologic malignancy. Presence of CH in solid tumor patients, including colon cancer, correlates with shorter survival. We hypothesized that bone marrow-derived cells with heterozygous loss-of-function mutations of DNMT3A , the most common genetic alteration in CH, contribute to the pathogenesis of colon cancer. In a mouse model that combines colitis-associated colon cancer with experimental CH driven by Dnmt3a +/Δ , we found higher tumor penetrance and increased tumor burden compared to controls. Histopathological analysis revealed accentuated colonic epithelium injury, dysplasia and adenocarcinoma formation. Transcriptome profiling of colon tumors identified enrichment of gene signatures associated with carcinogenesis, including angiogenesis. Treatment with the angiogenesis inhibitor axitinib eliminated the colon tumor-promoting effect of experimental CH driven by Dnmt3a haploinsufficiency. This study provides conceptually novel insights into non-tumor-cell-autonomous effect of hematopoietic alterations on colon carcinogenesis and identifies potential therapeutic strategies. SUMMARY A pre-clinical mouse model demonstrates that genetic alterations in the blood system characteristic of clonal hematopoiesis (CH) contribute to an aggressive solid tumor phenotype. It further identifies cancer angiogenesis as a potential therapeutic target to mitigate adverse CH effects.

ABSTRACT Mutations in the DNA methyltransferase 3A ( DNMT3A ) gene are recurrent in de novo acute myeloid leukemia (AML) and are associated with resistance to standard chemotherapy, disease relapse, and poor prognosis, especially in advanced-age patients. Previous gene expression studies in cells with DNMT3A mutations identified deregulation of cell cycle-related signatures implicated in DNA damage response and replication fork integrity, suggesting sensitivity to replication stress. Here we tested whether pharmacologically-induced replication fork stalling creates a therapeutic vulnerability in cells with DNMT3A (R882) mutations. We observed increased sensitivity to nucleoside analogs such as cytarabine in multiple cellular systems expressing mutant DNMT3A , ectopically or endogenously, in vitro and in vivo . Analysis of DNA damage signaling in response to cytarabine revealed persistent intra-S phase checkpoint activation, accompanied by accumulation of DNA damage in the DNMT3A (R882) overexpressing cells, which was only partially resolved after drug removal and carried through mitosis, resulting in micronucleation. Pulse-chase double-labeling experiments with EdU and BrdU after cytarabine wash-out demonstrated that cells with DNMT3A(mut) were able to restart replication but showed a higher rate of fork collapse. Gene expression profiling by RNA-seq identified deregulation of pathways associated with cell cycle progression and p53 activation, as well as metabolism and chromatin. Together, our studies show that cells with DNMT3A mutations have a defect in recovery from replication fork arrest and subsequent accumulation of unresolved DNA damage, which may have therapeutic tractability. These results demonstrate that, in addition to its role in epigenetic control, DNMT3A contributes to preserving genome integrity during DNA replication.