The giant sarcomeric protein titin contains a protein kinase domain (TK) ideally positioned to sense mechanical load. We identified a signaling complex where TK interacts with the zinc-finger protein nbr1 through a mechanically inducible conformation. Nbr1 targets the ubiquitin-associated p62/SQSTM1 to sarcomeres, and p62 in turn interacts with MuRF2, a muscle-specific RING-B-box E3 ligase and ligand of the transactivation domain of the serum response transcription factor (SRF). Nuclear translocation of MuRF2 was induced by mechanical inactivity and caused reduction of nuclear SRF and repression of transcription. A human mutation in the titin protein kinase domain causes hereditary muscle disease by disrupting this pathway.

Each of the myogenic helix-loop-helix transcription factors (MyoD, Myogenin, Myf-5, and MRF4) is capable of activating muscle-specific gene expression, yet distinct functions have not been ascribed to the individual proteins. We report here that MyoD and Myogenin mRNAs selectively accumulate in hindlimb muscles of the adult rat that differ in contractile properties: MyoD is prevalent in fast twitch and Myogenin in slow twitch muscles. The distribution of MyoD and Myogenin transcripts also differ within a single muscle and correlate with the proportions of fast glycolytic and slow oxidative muscle fibres, respectively. Furthermore, the expression of a transgene consisting of a muscle-specific cis-regulatory region from the myoD gene controlling lacZ was primarily associated with the fast glycolytic fibres. Alteration of the fast/slow fibre type distribution by thyroid hormone treatment or by cross-reinnervation resulted in a corresponding alteration in the MyoD/Myogenin mRNA expression pattern. These findings show that the expression of specific myogenic helix-loop-helix regulators is under the control of innervation and humoral factors and may mediate differential control of contractile protein gene expression in adult muscle.

Abstract Generation of viable offspring depends both on genetic and environmental factors of both mother and child. Analysis of a likely amorphic allele of the zebrafish epidermal growth factor receptor a ( egfra ) gene revealed that heterozygous females were infertile due to death of all fertilized eggs during embryonic and early larval life with cardiac, tail and other defects. Comparison of the severe dominant maternal effect with previous studies using pharmacological inhibitors of Egfrs or antisense morpholino injection indicate that a normal level of maternal Egfra is required for viability of offspring both during egg development and in the embryo after fertilisation. As heterozygous mothers were not fertile, the homozygous zygotic egfra kg134 phenotype could not be analysed. Heterozygous egfra +/kg134 males crossed to wild type females produced fully viable offspring, among which egfra +/kg134 individuals had increased slow muscle but no functional motility defect. Our findings suggest that Egfra activity is crucial for early development both before and after fertilisation and are likely to constitute a rare example of a haploinsufficient maternal effect in a species lacking imprinting.

Abstract Growth and maintenance of skeletal muscle fibres depend on coordinated activation and return to quiescence of resident muscle stem-cells (MuSCs). The transcription factor Myogenin (Myog) regulates myocyte fusion during development, but its role in adult myogenesis remains unclear. In contrast to mice, myog −/− zebrafish are viable, but have hypotrophic muscles. By isolating adult myofibres with associated MuSCs we found that myog −/− myofibres have severely reduced nuclear number, but increased myonuclear domain size. Expression of fusogenic genes is decreased, pax7 upregulated, MuSCs are fivefold more numerous and mis-positioned throughout the length of myog −/− myofibers instead of localising at myofibre ends as in wild-type. Loss of Myog dysregulates mTORC1 signalling, resulting in an ‘alerted’ state of MuSCs, which display precocious activation and faster cell cycle entry ex vivo, concomitant with myod upregulation. Thus, beyond controlling myocyte fusion, Myog influences the MuSC:niche relationship, demonstrating a multi-level contribution to muscle homeostasis throughout life.

Muscle tissue shows circadian variation, but whether and how the intracellular circadian clock per se regulates muscle growth remains unclear. By measuring muscle growth over 12 h periods, here we show that muscle grows more during the day than at night. Inhibition of muscle contraction reduces growth to a similar extent in day and night, but does not ablate the circadian variation in growth. Muscle protein synthesis is higher during the day compared to night, whereas markers of protein degradation are higher at night. Mechanistically, the TORC1 inhibitor rapamycin inhibits the extra daytime growth, but no effect on muscle growth at night was detected. Conversely, the proteasomal inhibitor MG132 increases muscle growth at night, but has no effect during the day, irrespective of activity. Ablation of contractile activity rapidly reduces muscle protein synthesis both during the day and at night and leads to a gradual increase in Murf gene expression without ablating circadian variation in growth. Removal of circadian input by exposure to either permanent light or permanent darkness reduces muscle growth. We conclude that circadian variation in muscle growth is independent of the presence of, or changes in, physical activity and affects both protein synthesis and degradation in distinct circadian phases.

Abstract To address questions of stem cell diversity during skeletal myogenesis, a Brainbow-like genetic cell lineage tracing method, dubbed Musclebow , was derived by enhancer trapping in zebrafish. It is shown that at least 15 muscle precursor cells (mpcs) seed each somite, where they proliferate but contribute little to muscle growth prior to hatching. Thereafter, dermomyotome-derived mpc clones rapidly expand while some progeny undergo terminal differentiation, leading to stochastic clonal drift. No evidence of cell lineage-based clonal fate diversity was obtained. Neither fibre nor mpc death was observed in uninjured animals. Individual marked muscle fibres persist across much of the lifespan indicating low rates of nuclear turnover. In adulthood, early-marked mpc clones label stable blocks of tissue comprising a significant fraction of either epaxial or hypaxial somite. Fusion of cells from separate early-marked clones occurs in regions of clone overlap. Wounds are regenerated from many/most local mpcs; no evidence for specialised stem mpcs was obtained. In conclusion, our data indicate that most mpcs in muscle tissue contribute to local growth and repair and suggest that cellular turnover is low in the absence of trauma. Summary Statement Musclebow clonal cell lineage analysis is introduced to reveal the cellular dynamics of skeletal muscle formation, repair and maintenance throughout the life of zebrafish.

Abstract Desmin is a muscle-specific intermediate filament protein that has fundamental role in muscle structure and force transmission. Whereas human desmin protein is encoded by a single gene, two desmin paralogs ( desma and desmb ) exist in zebrafish. Desma and desmb show differential spatiotemporal expression during zebrafish embryonic and larval development, being similarly expressed in skeletal muscle until hatching, after which expression of desmb shifts to gut smooth muscle. We generated knockout (KO) mutant lines carrying loss-of-function mutations for each gene by using CRISPR/Cas9. Mutants are viable and fertile, and lack obvious skeletal muscle, heart or intestinal defects. In contrast to morphants, knockout of each gene did not cause any overt muscular phenotype, but did alter calcium flux in myofibres. These results point to a possible compensation mechanism in these mutant lines generated by targeting nonsense mutations to the first coding exon.

Balancing the number of stem cells and their progeny is crucial for tissue development and repair. Here we examine how muscle stem/precursor cell (MPC) numbers are tightly regulated during zebrafish somitic muscle development. MPCs expressing Pax7 are initially located in the dermomyotome (DM) external cell layer, adopt a highly stereotypical distribution and thereafter a proportion of MPCs migrate into the myotome. Regional variations in the proliferation and terminal differentiation of MPCs contribute to growth of the myotome. To probe the robustness of spatiotemporal regulation of MPCs, we compared the behaviour of wild type (wt) MPCs with those in mutant zebrafish that lack the muscle regulatory factor Myod. Myodfh261 mutants form one third fewer multinucleate fast muscle fibres than wt and show a significant expansion of the Pax7+ MPC population in the DM. Subsequently, myodfh261 mutant fibres generate more cytoplasm per nucleus, leading to recovery of muscle bulk. In addition, relative to wt siblings, there is an increased number of MPCs in myodfh261 mutants and these migrate prematurely into the myotome, differentiate and contribute to the hypertrophy of existing fibres. Thus, homeostatic reduction of the excess MPCs returns their number to normal levels, but fibre numbers remain low. The GSK3 antagonist BIO prevents MPC migration into the deep myotome, suggesting that canonical Wnt pathway activation maintains the DM in zebrafish, as in amniotes. BIO does not, however, block recovery of the myodfh261 mutant myotome, indicating that homeostasis acts on fibre intrinsic growth to maintain muscle bulk. The findings suggest the existence of a critical window for early fast fibre formation followed by a period in which homeostatic mechanisms regulate myotome growth by controlling fibre size.

Skeletal muscle derives from dorsal mesoderm that is formed during vertebrate gastrulation. Fibroblast growth factor (Fgf) signalling is known to cooperate with transcription factors of the Tbx family to promote dorsal mesoderm formation, but the role of these proteins in skeletal myogenesis has been unclear. Using the zebrafish, we show that dorsally-derived Fgf signals act through Tbx16 and Tbxta to induce two populations of slow and fast trunk muscle precursors at distinct dorsoventral positions. Tbx16 binds to and directly activates the myf5 and myod genes that are required for commitment to skeletal myogenesis. Tbx16 activity depends on Fgf signalling from the organiser. In contrast, Tbxta is not required for myf5 expression. However, Tbxta binds to a specific site upstream of myod not bound by Tbx16, driving myod expression in the adaxial slow precursors dependent upon Fgf signals, thereby initiating muscle differentiation in the trunk. After gastrulation, when similar muscle cell populations in the post-anal tail are generated from the tailbud, declining Fgf signalling is less effective at initiating adaxial myogenesis, which is instead initiated by Hedgehog signalling from the notochord. Our findings provide insight into the ancestral vertebrate trunk myogenic pattern and how it was co-opted during tail evolution to generate similar muscle by new mechanisms.