The development of an effective vaccine and specific antiviral therapies against hepatitis C virus (HCV), a leading cause of liver disease, has been hampered by the lack of a convenient small animal model. With the identification of the gap junction protein occludin as the fourth and final key component of the hepatitis C virus cell-entry receptor, that elusive lab model may have come a step nearer. In addition to human occludin, viral infection of murine cells requires expression of the previously identified HCV entry factors CD81, scavenger receptor class B type I, and claudin-1. This report identifies the gap junction protein occludin as the fourth and final key component of the hepatitis C virus cell-entry receptor, paving the way towards the development of a small animal model for hepatitis C virus. Hepatitis C virus (HCV) is a leading cause of liver disease worldwide. The development of much needed specific antiviral therapies and an effective vaccine has been hampered by the lack of a convenient small animal model. The determinants restricting HCV tropism to human and chimpanzee hosts are unknown. Replication of the viral RNA has been demonstrated in mouse cells1,2, but these cells are not infectable with either lentiviral particles bearing HCV glycoproteins (HCVpp)3 or HCV produced in cell culture (HCVcc) (A.P., M.E. and C.M.R., unpublished observations), suggesting that there is a block at the level of entry. Here we show, using an iterative complementary DNA library screening approach, that human occludin (OCLN) is an essential HCV cell entry factor that is able to render murine cells infectable with HCVpp. Similarly, OCLN is required for the HCV-susceptibility of human cells, because its overexpression in uninfectable cells specifically enhanced HCVpp uptake, whereas its silencing in permissive cells impaired both HCVpp and HCVcc infection. In addition to OCLN, HCVpp infection of murine cells required expression of the previously identified HCV entry factors CD81 (ref. 4), scavenger receptor class B type I (SR-BI, also known as SCARB1)5 and claudin-1 (CLDN1)6. Although the mouse versions of SR-BI and CLDN1 function at least as well as the human proteins in promoting HCV entry, both OCLN and CD81 must be of human origin to allow efficient infection. The species-specific determinants of OCLN were mapped to its second extracellular loop. The identification of OCLN as a new HCV entry factor further highlights the importance of the tight junction complex in the viral entry process, and provides an important advance towards efforts to develop small animal models for HCV.

Summary

 The mammalian liver possesses a remarkable regenerative ability. Two modes of damage response have been described: (1) The "oval cell" response emanates from the biliary tree when all hepatocytes are affected by chronic liver disease. (2) A massive, proliferative response of mature hepatocytes occurs upon acute liver damage such as partial hepatectomy (PHx). While the oval cell response has been captured in vitro by growing organoids from cholangiocytes, the hepatocyte proliferative response has not been recapitulated in culture. Here, we describe the establishment of a long-term 3D organoid culture system for mouse and human primary hepatocytes. Organoids can be established from single hepatocytes and grown for multiple months, while retaining key morphological, functional and gene expression features. Transcriptional profiles of the organoids resemble those of proliferating hepatocytes after PHx. Human hepatocyte organoids proliferate extensively after engraftment into mice and thus recapitulate the proliferative damage-response of hepatocytes.

Hepatitis C virus (HCV) uniquely requires the liver-specific microRNA-122 for replication, yet global effects on endogenous miRNA targets during infection are unexplored. Here, high-throughput sequencing and crosslinking immunoprecipitation (HITS-CLIP) experiments of human Argonaute (AGO) during HCV infection showed robust AGO binding on the HCV 5′UTR at known and predicted miR-122 sites. On the human transcriptome, we observed reduced AGO binding and functional mRNA de-repression of miR-122 targets during virus infection. This miR-122 "sponge" effect was relieved and redirected to miR-15 targets by swapping the miRNA tropism of the virus. Single-cell expression data from reporters containing miR-122 sites showed significant de-repression during HCV infection depending on expression level and site number. We describe a quantitative mathematical model of HCV-induced miR-122 sequestration and propose that such miR-122 inhibition by HCV RNA may result in global de-repression of host miR-122 targets, providing an environment fertile for the long-term oncogenic potential of HCV.

Significance Major obstacles for using human hepatocytes to study hepatitis B virus (HBV) pathobiology are rapid loss of hepatocyte function after plating and the variability between hepatocyte donors. We show that micropatterning and coculturing of primary human hepatocytes with fibroblasts (MPCC format) maintains prolonged infection that is restricted by the innate immune response, and can be further boosted by suppression of this response. To address the problem of donor variability, we show that induced pluripotent stem cells (iPSC) differentiated into hepatocyte-like cells support HBV infection in a differentiation-dependent manner. Our study opens an avenue for using these systems to study virus–host interactions and test antiviral drugs, and suggests HBV permissiveness as a surrogate reporter to assess the degree of differentiation of candidate iPSC-derived hepatocyte-like cells.

ABSTRACT Advanced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a rapidly emerging global health problem associated with pre-disposing genetic polymorphisms, most strikingly an isoleucine to methionine substitution in patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3-I148M). Here, we study how human hepatocytes with PNPLA3 148I and 148M variants engrafted in the livers of chimeric mice respond to a hypercaloric Western-style diet. As early as 4 weeks, mice developed dyslipidemia, impaired glucose tolerance, and steatohepatitis selectively in the human graft, followed by pericellular fibrosis after 8 weeks of hypercaloric feeding. The PNPLA3 148M variant, either from a homozygous 148M human donor or overexpressed in a homozygous 148I donor background, caused widespread microvesicular steatosis and even more severe steatohepatitis. We conclude that PNPLA3 148M in human hepatocytes exacerbates NAFLD. These models will facilitate mechanistic studies into human genetic variants associated with advanced fatty liver diseases.

Abstract Fibrolamellar hepatocellular carcinoma (FLC) is a rare liver cancer that is driven by a fusion of DNAJB1 and PRKACA, the catalytic subunit of protein kinase A (PKA). PKA activity is controlled through regulatory proteins that both inhibit catalytic activity and control localization, and an excess of regulatory subunits ensures PRKACA activity is inhibited. Here, we found an increase in the ratio of catalytic to regulatory units in FLC patient tumors driven by DNAJB1::PRKACA using mass spectrometry, biochemistry, and immunofluorescence, with increased nuclear localization of the kinase. Overexpression of DNAJB1::PRKACA, ATP1B1::PRKACA, or PRKACA, but not catalytically inactive kinase, caused similar transcriptomic changes in primary human hepatocytes, recapitulating the changes observed in FLC. Consistently, tumors in patients missing a regulatory subunit or harboring an ATP1B1::PRKACA fusion were indistinguishable from FLC based on the histopathological, transcriptomic, and drug-response profiles. Together, these findings indicate that the DNAJB1 domain of DNAJB1::PRKACA is not required for FLC. Instead, changes in PKA activity and localization determine the FLC phenotype

Gene therapy for severe hemophilia A employs an adeno-associated virus (AAV) vector and liver-specific promoters that depend on healthy hepatocyte function to achieve safe and long-lasting increases in FVIII activity. Thus, hepatocyte health is an essential aspect of safe and successful gene therapy. Many people living with hemophilia A have current or past chronic hepatitis C virus infection, metabolic dysfunction-associated steatosis or steatohepatitis, or other conditions that may compromise the efficacy and safety of AAV-mediated gene therapy. In addition, gene therapy may induce an immune response to transduced hepatocytes, leading to liver inflammation and reduced FVIII activity. The immune response can be treated with immunosuppression, but close monitoring of liver function tests and factor levels is necessary. The long-term risk of hepatocellular carcinoma associated with gene therapy is unknown. Routine screening by imaging for hepatocellular carcinoma, preferable every 6 months, is essential in patients at high risk and recommended in all recipients of hemophilia A gene therapy. This paper describes our current understanding of the biologic underpinnings of how liver health affects hemophilia A gene therapy, and provides practical clinical guidance for assessing, monitoring, and managing liver health both before and after gene therapy.

Abstract Hemophilia A gene therapy targets hepatocytes to express B domain deleted-(BDD) clotting factor VIII (FVIII) to permit viral encapsidation. Since BDD is prone to misfolding in the endoplasmic reticulum (ER) and ER protein misfolding in hepatocytes followed by high fat diet (HFD) can cause hepatocellular carcinoma (HCC), we studied how FVIII misfolding impacts HCC development using hepatocyte DNA delivery to express three proteins from the same parental vector: 1) well-folded cytosolic dihydrofolate reductase (DHFR); 2) BDD-FVIII, which is prone to misfolding in the ER; and 3) N6-FVIII which folds more efficiently than BDD-FVIII. One week after DNA delivery, when FVIII expression was undetectable, mice were fed HFD for 65 weeks. Remarkably, all mice that received BDD-FVIII vector developed liver tumors, whereas only 58% of mice that received N6 and no mice that received DHFR vector developed liver tumors, suggesting that the degree of protein misfolding in the ER increases predisposition to HCC in the context of a HFD and in the absence of viral transduction. Our findings raise concerns of ectopic BDD-FVIII expression in hepatocytes in the clinic, which poses risks independent of viral vector integration. Limited expression per hepatocyte and/or use of proteins that avoid misfolding may enhance safety. Graphical abstract

Hepatitis B virus infects non-dividing cells in which dNTPs are scarce. HBV replication requires dNTPs. To cope with this constraint the virus induces the DNA damage response (DDR) pathway culminating in RNR-R2 expression and the generation of an active RNR holoenzyme, the key regulator of dNTP levels. Previously we reported that the HBx open reading frame (ORF) triggers this pathway. Unexpectedly however, we report here that the production of HBx protein is not essential. We found that a small region of 125 bases within the HBx transcript is sufficient to induce RNR-R2 expression in growth arrested HepG2 cells and in primary human hepatocytes (PHH). The observed HBx embedded regulatory element is named ERE. We demonstrate that ERE is functional as a positive strand RNA polymerase-II transcript. Remarkably, ERE is sufficient to induce the Chk1-E2F1-RNR-R2 DDR pathway, previously reported to be activated by HBV. Furthermore, we found that ERE activates ATR but not ATM in eliciting this DDR pathway in upregulating RNR-R2. These findings demonstrate the multitasking role of HBV transcripts in mediating virus-host cell interaction, a mechanism that explains how such a small genome effectively serves such a pervasive virus.

Although there is no effective cure for chronic hepatitis B virus (HBV) infection, antibodies are protective and constitute clinical correlates of recovery from infection. To examine the human neutralizing antibody response to HBV in elite neutralizers we screened 144 individuals. The top individuals produced shared clones of broadly neutralizing antibodies (bNAbs) that targeted 3 non-overlapping epitopes on the HBV S antigen (HBsAg). Single bNAbs protected humanized mice against infection, but selected for resistance mutations in mice with established infection. In contrast, infection was controlled by a combination of bNAbs targeting non-overlapping epitopes with complementary sensitivity to mutations that commonly emerge during human infection. The co-crystal structure of one of the bNAbs with a peptide epitope containing residues frequently mutated in human immune escape variants revealed a loop anchored by oppositely charged residues. The structure provides a molecular explanation for why immunotherapy for HBV infection may require combinations of complementary bNAbs.