Abstract Although manganese is an essential trace metal, little is known about its transport and homeostatic regulation. Here we have identified a cohort of patients with a novel autosomal recessive manganese transporter defect caused by mutations in SLC39A14. Excessive accumulation of manganese in these patients results in rapidly progressive childhood-onset parkinsonism–dystonia with distinctive brain magnetic resonance imaging appearances and neurodegenerative features on post-mortem examination. We show that mutations in SLC39A14 impair manganese transport in vitro and lead to manganese dyshomeostasis and altered locomotor activity in zebrafish with CRISPR-induced slc39a14 null mutations. Chelation with disodium calcium edetate lowers blood manganese levels in patients and can lead to striking clinical improvement. Our results demonstrate that SLC39A14 functions as a pivotal manganese transporter in vertebrates.

Abstract Myelodysplastic syndrome (MDS) is a haematological malignancy characterised by blood cytopenias and predisposition to acute myeloid leukaemia (AML). Therapies for MDS are lacking, particularly those that impact the early stages of disease. We developed a model of MDS using zebrafish using knockout of Rps14, the primary mediator of the anaemia associated with del (5q) MDS. These mutant animals display dose- and age-dependent abnormalities in haematopoiesis, culminating in bone marrow failure with dysplastic features. We utilized rps14 knockdown to undertake an in vivo small molecule screen to identify compounds that ameliorate the MDS phenotype, identifying imiquimod, an agonist of TLR7 and TLR8. Imiquimod alleviates anaemia by promoting haematopoietic stem and progenitor cell expansion and erythroid differentiation, the mechanism of which is dependent on TLR7 ligation. TLR7 activation in this setting paradoxically promoted an anti-inflammatory gene signature suggesting crosstalk between pro-inflammatory pathways endogenous to Rps14 loss and TLR7 pathway activation. Finally, we show that in highly purified human bone marrow samples from anaemic patients, imiquimod leads to an increase in erythroid output from myelo-erythroid progenitors and common myeloid progenitors. Our findings have both specific implications for the development of targeted therapeutics for del (5q) MDS and wider significance identifying a potential role for TLR7 ligation in modifying anaemia.

Mutations in SLC39A14, a manganese uptake transporter, lead to a neurodegenerative disorder characterised by accumulation of manganese in the brain and rapidly progressive dystonia-parkinsonism (Hypermanganesemia with Dystonia 2, HMNDYT2). Similar to the human phenotype, zebrafish slc39a14U801-/- mutants show prominent brain manganese accumulation and abnormal locomotor behaviour. In order to identify novel potential targets of manganese neurotoxicity, we performed transcriptome analysis of individual homozygous mutant and sibling slc39a14U801 zebrafish at five days post fertilisation unexposed and exposed to MnCl2. Anatomical gene enrichment analysis confirmed that differentially expressed genes map to the central nervous system and eye. Biological interpretation of differentially expressed genes suggests that calcium dyshomeostasis, activation of the unfolded protein response, oxidative stress, mitochondrial dysfunction, lysosomal disruption, apoptosis and autophagy, and interference with proteostasis are key events in manganese neurotoxicity. Differential expression of visual phototransduction genes also predicted visual dysfunction in mutant larvae which was confirmed by the absence of visual background adaptation and a diminished optokinetic reflex. Surprisingly, we found a group of differentially expressed genes in mutant larvae that normalised upon MnCl2 treatment suggesting that, in addition to neurotoxicity, manganese deficiency is present either subcellularly or in specific cells or tissues. This may have important implications for treatment as manganese chelation may aggravate neurological symptoms. Our analyses show that slc39a14U801-/- mutant zebrafish present a powerful model to study the cellular and molecular mechanisms underlying disrupted manganese homeostasis.

Through forward genetic screening for mutations affecting visual system development, we identified prominent coloboma and cell-autonomous retinal neuron differentiation, lamination and retinal axon projection defects in eisspalte (ele) mutant zebrafish. Additional axonal deficits were present, most notably at midline axon commissures. Genetic mapping and cloning of the ele mutation showed that the affected gene is slbp, which encodes a conserved RNA stem-loop binding protein involved in replication dependent histone mRNA metabolism. Cells throughout the central nervous system remained in the cell cycle in ele mutant embryos at stages when, and locations where, post-mitotic cells have differentiated in wild-type siblings. Indeed, RNAseq analysis showed down-regulation of many genes associated with neuronal differentiation. This was coincident with changes in the levels and spatial localisation of expression of various genes implicated, for instance, in axon guidance, that likely underlie specific ele phenotypes. These results suggest that many of the cell and tissue specific phenotypes in ele mutant embryos are secondary to altered expression of modules of developmental regulatory genes that characterise, or promote transitions in, cell state and require the correct function of Slbp-dependent histone and chromatin regulatory genes.

1. Abstract Zebrafish telencephalon acquires an everted morphology by a two-step process that occurs from 1 to 5 days post-fertilization (dpf). Little is known about how this process affects the positioning of discrete telencephalic cell populations, hindering our understanding of how eversion impacts telencephalic structural organisation. In this study, we characterise the neurochemistry, cycle state and morphology of an EGFP positive (+) cell population in the telencephalon of Et( gata2 : EGFP ) bi105 transgenic fish during eversion and up to 20dpf. We map the transgene insertion to the early-growth-response-gene-3 ( egr3 ) locus and show that EGFP expression recapitulates endogenous egr3 expression throughout much of the pallial telencephalon. Using the gata2:EGFP bi105 transgene, in combination with other well-characterised transgenes and structural markers, we track the development of various cell populations in the zebrafish telencephalon as it undergoes the morphological changes underlying eversion. These datasets were registered to reference brains to form an atlas of telencephalic development at key stages of the eversion process (1dpf, 2dpf and 5dpf) and compared to expression in adulthood. Finally, we registered gata2:EGFP bi105 expression to the Zebrafish Brain Browser 6dpf reference brain (ZBB, see Marquart et al., 2015, 2017; Tabor et al. 2019), to allow comparison of this expression pattern with anatomical data already in ZBB.