Abstract It is unclear how gene order within the chromosome influences bacterial evolution. The genomic location of genes encoding the flow of genetic information is biased towards the replication origin ( oriC ) in fast-growing bacteria. To study the role of chromosomal location on cell physiology we relocated the S10-spec- α locus (S10), harboring half of ribosomal protein genes, to different chromosomal positions in the fast-growing pathogen V. cholerae . We found that growth rate, fitness and infectivity inversely correlated the distance between S10 and oriC . To gain insight into the evolutionary effect of ribosomal protein genomic position, we evolved strains bearing S10 at its current oriC -proximal location or derivatives where the locus far from it, at the chromosomal termini. All populations increased their growth rate along the experiment regardless S10 genomic location. However, the growth rate advantage of an oriC -proximal location persisted along experimental evolution indicating that suppressor mutations cannot compensate S10 genomic position. An increment in biofilm forming capacity was another common trait observed along the experiment. Deep sequencing of populations showed on average 1 mutation fixed each 100 generations, mainly at genes linked to flagellum biosynthesis regulation, lipopolysaccharide synthesis, chemotaxis, biofilm and quorum sensing. We selected fast-growing clones displaying a ∼10% growth rate increment. We found that they harbored inactivating mutations at, among other sites, the flagellum master regulators flrAB . The introduction of these mutations into naïve V. cholerae strains resulted in a ∼10% increase of growth rate. Our study therefore demonstrates that the location of ribosomal protein genes conditions the evolutionary trajectory of growth rate in the long term. While genomic content is highly plastic in prokaryotes, gene order is an underestimated factor that conditions cellular physiology and lineage evolution. The lack of suppression enables artificial gene relocation for genetic circuit reprogramming.

ABSTRACT The health and environmental risks associated with antibiotic use in aquaculture have promoted bacterial probiotics as an alternative approach to control fish infections in vulnerable larval and juvenile stages. However, evidence-based identification of probiotics is often hindered by the complexity of bacteria-host interactions and host variability in microbiologically uncontrolled conditions. While these difficulties can be partially resolved using gnotobiotic models harboring no or reduced microbiota, most host-microbe interaction studies are carried out in animal models with little relevance for fish farming. Here we studied host-microbiota-pathogen interactions in a germ-free and gnotobiotic model of rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ), one of the most widely cultured salmonids. We demonstrated that germ-free larvae raised in sterile conditions displayed no significant difference in growth after 35 days compared to conventionally-raised larvae, but were extremely sensitive to infection by Flavobacterium columnare , a common freshwater fish pathogen causing major economic losses worldwide. Furthermore, re-conventionalization with 11 culturable species from the conventional trout microbiota conferred resistance to F. columnare infection. Using mono-re-conventionalized germ-free trout, we identified that this protection is determined by a commensal Flavobacterium strain displaying antibacterial activity against F. columnare . Finally, we demonstrated that use of gnotobiotic trout is a suitable approach for the systematic identification of both endogenous and exogenous probiotic bacterial strains that may protect teleostean hosts against F. columnare and other pathogens. This study establishes a novel and ecologically-relevant gnotobiotic model that will improve the sustainability and health of aquaculture.

ABSTRACT The long-known resistance to pathogens provided by host-associated microbiota fostered the notion that adding protective bacteria could prevent or attenuate infection. However, the identification of endogenous or exogenous bacteria conferring such protection is often hindered by the complexity of host microbial communities. Here, we used zebrafish and the fish pathogen Flavobacterium columnare as a model system to study the determinants of microbiota-associated colonization resistance. We compared infection susceptibility in germ-free, conventional and re-conventionalized larvae and showed that a consortium of 10 culturable bacterial species are sufficient to protect zebrafish. Whereas survival to F. columnare infection does not rely on host innate immunity, we used antibiotic dysbiosis to alter zebrafish microbiota composition, leading to the identification of two different protection strategies. We first identified that the bacterium Chryseobacterium massiliae individually protects both larvae and adult zebrafish. We also showed that an assembly of 9 endogenous zebrafish species that do not otherwise protect individually confer a community-level resistance to infection. Our study therefore provides a rational approach to identify key endogenous protecting bacteria and promising candidates to engineer resilient microbial communities. It also shows how direct experimental analysis of colonization resistance in low-complexity in vivo models can reveal unsuspected ecological strategies at play in microbiota-based protection against pathogens.

ABSTRACT Many eukaryotic membrane-dependent functions are often spatially and temporally regulated by membrane microdomains (FMMs) also known as lipid rafts. These domains are enriched in polyisoprenoid lipids and scaffolding proteins belonging to the Stomatin, Prohibitin, Flotillin, and HflK/C (SPFH) protein superfamily that was also identified in Gram-positive bacteria. By contrast, little is still known about FMMs in Gram-negative bacteria. In Escherichia coli K12, 4 SPFH proteins, YqiK, QmcA, HflK, and HflC, were shown to localize in discrete polar or lateral inner-membrane locations, raising the possibility that E. coli SPFH proteins could contribute to the assembly of inner-membrane FMMs and the regulation of cellular processes. Here we studied the determinant of the localization of QmcA and HflC and showed that FMM-associated cardiolipin lipid biosynthesis is required for their native localization pattern. Using Biolog phenotypic arrays, we showed that a mutant lacking all SPFH genes displayed increased sensitivity to aminoglycosides and oxidative stress that is due to the absence of HflKC. Our study therefore provides further insights into the contribution of SPFH proteins to stress tolerance in E. coli . IMPORTANCE Eukaryotic cells often segregate physiological processes in cholesterol-rich functional membrane micro-domains. These domains are also called lipid rafts and contain proteins of the Stomatin, Prohibitin, Flotillin, and HflK/C (SPFH) superfamily, which are also present in prokaryotes but were mostly studied in Gram-positive bacteria. Here, we showed that the cell localization of the SPFH proteins QmcA and HflKC in the Gram-negative bacteria E. coli is altered in absence of cardiolipin lipid synthesis. This suggests that cardiolipins contribute to E. coli membrane microdomain assembly. Using a broad phenotypic analysis, we also showed that HflKC contribute to E. coli tolerance to aminoglycosides and oxidative stress. Our study, therefore, provides new insights into the cellular processes associated with SPFH proteins in E. coli .