The apolipoprotein E4 (APOE4) variant is the single greatest genetic risk factor for sporadic Alzheimer’s disease (sAD). However, the cell-type-specific functions of APOE4 in relation to AD pathology remain understudied. Here, we utilize CRISPR/Cas9 and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to examine APOE4 effects on human brain cell types. Transcriptional profiling identified hundreds of differentially expressed genes in each cell type, with the most affected involving synaptic function (neurons), lipid metabolism (astrocytes), and immune response (microglia-like cells). APOE4 neurons exhibited increased synapse number and elevated Aβ42 secretion relative to isogenic APOE3 cells while APOE4 astrocytes displayed impaired Aβ uptake and cholesterol accumulation. Notably, APOE4 microglia-like cells exhibited altered morphologies, which correlated with reduced Aβ phagocytosis. Consistently, converting APOE4 to APOE3 in brain cell types from sAD iPSCs was sufficient to attenuate multiple AD-related pathologies. Our study establishes a reference for human cell-type-specific changes associated with the APOE4 variant.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiJhMjEwM2U1MTllMDU5ZTU5NzQzNzFiY2ZkYzY2YjFmOCIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc3ODM3NDAyfQ.cm_8iE6yPyIUtMA9CHuHdkKCpDzSoengfWtrTwQuK91RUFDu5wgXxv6w0LkGp3xIp4Q5ONl1L-nEkyqiD8y5XsDnNu29a6FOVkKPbcXQ_rWezgdGcufenbm5VD4lQ1jJIc236lH69WCL0EIWXgL49CYD2U02kBteDYs3OdY1fThG2C3slE8IyHEB1o6NHHpsyMLHAmkJEPUA_fNRg-NiC_Jk2khN70bJRGkX4pcIpAoo3inlbuuEHi04BCX2aBnzpTJZyManAMJK6AdyelKmaFWjYH93z-Dp8wadAwqXUIZj2l9ykRD2ucitOOP0XLYH-FJ4t9yO_sESEIZQ6NGSaQ(mp4, (11.59 MB) Download video

P-element-induced gap repair was used to copy nonhomologous DNA into the Drosophila white locus. We found that nearly 8,000 bp of nonhomologous sequence could be copied from an ectopic template at essentially the same rate as a single-base substitution at the same location. An in vitro-constructed deletion was also copied into white at high frequencies. This procedure can be applied to the study of gene expression in Drosophila melanogaster, especially for genes too large to be manipulated in other ways. We also observed several types of more complex events in which the copied template sequences were rearranged such that the breakpoints occurred at direct duplications. Most of these can be explained by a model of double strand break repair in which each terminus of the break invades a template independently and serves as a primer for DNA synthesis from it, yielding two overlapping single-stranded sequences. These single strands then pair, and synthesis is completed by each using the other as a template. This synthesis-dependent strand annealing (SDSA) model as a possible general mechanism in complex organisms is discussed.

Abstract Genetic findings have highlighted key roles for microglia in the pathology of neurodegenerative conditions such as Alzheimer’s disease (AD). Distinct mutations in the microglial protein TREM2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2) are associated with different forms of neurodegeneration in humans; R47H/+ mutations increase AD risk, while loss-of-function mutations such as TREM2 T66M result in more severe forms of neurodegeneration. We employed gene editing and stem cell models to gain insight into the effects of these mutations on human iPSC-derived microglia. We found divergent effects of TREM2 R47H/+ and T66M mutations on gene expression, with R47H/+ cells exhibiting a pro-inflammatory gene expression signature. Both the TREM2 R47H/+ and T66M mutations caused similar impairments in microglial movement and the uptake of multiple substrates, while R47H/+ microglia were hyper-responsive to inflammatory stimuli, consistent with their gene expression signature. We developed an in vitro laser-induced injury model in neuron-microglia co-cultures, finding an impaired injury response by TREM2 R47H/+ microglia. Furthermore, in xenotransplantation experiments, mouse brains transplanted with TREM2 R47H/+ microglia exhibited reduced synaptic density. Consistently, we observed upregulation of multiple complement cascade components in TREM2 R47H/+ microglia, suggesting that inappropriate synaptic pruning may underlie the effect. Thus, these findings identify shared and distinct effects of these two TREM2 mutations on microglial gene expression and function. While the TREM2 T66M mutation impairs microglial movement and uptake processes, the TREM2 R47H/+ mutation additionally confers multiple potentially detrimental effects on human microglia, likely to underlie its association with AD.

Abstract Aberrant activity of cyclin-dependent kinase (Cdk5) has been implicated in various neurodegenerative diseases. This effect is mediated by pathological cleavage of the Cdk5 activator p35 to produce the truncated product p25, exhibiting increased stability and altered substrate specificity. The benefit of blocking p25 production has been demonstrated in various rodent and human neurodegenerative models. However, important Cdk5/p35 functions in the developing and adult brain have made it challenging to selectively target the detrimental effects of Cdk5/p25 while sparing the physiological functions of Cdk5/p35. Here, we report a 12-amino acid-long peptide fragment derived from Cdk5 (the Cdk5 inhibitory (Cdk5i) peptide) that shows a high binding affinity toward the Cdk5/p25 complex and can efficiently and selectively inhibit Cdk5/p25 kinase activity. Using cellular assays, mouse neurodegeneration models and human cerebral organoids generated from patient-derived iPSCs, we demonstrate beneficial effects of the Cdk5i peptide on various pathological phenotypes including gliosis, DNA damage, and Tau hyperphosphorylation.

Summary Alzheimer’s disease (AD) is characterized by the appearance of amyloid-β plaques, neurofibrillary tangles, and inflammation in brain regions involved in memory. Using mass spectrometry, we have quantified the phosphoproteome of the CK-p25, 5XFAD, and Tau P301S mouse models of neurodegeneration. We identified a shared response involving Siglec-F which was upregulated on a subset of reactive microglia. The human paralog Siglec-8 was also upregulated on microglia in AD. Siglec-F and Siglec-8 were upregulated following microglial activation with interferon gamma (IFNγ) in BV-2 cell line and human stem-cell derived microglia models. Siglec-F overexpression activates an endocytic and pyroptotic inflammatory response in BV-2 cells, dependent on its sialic acid substrates and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM) phosphorylation sites. Related human Siglecs induced a similar response in BV-2 cells. Collectively, our results point to an important role for mouse Siglec-F and human Siglec-8 in regulating microglial activation during neurodegeneration. Highlights Phosphoproteomics analysis of CK-p25, 5XFAD, and Tau P301S mouse models finds dysregulated signaling networks associated with Alzheimer’s disease pathologies. A phosphorylation site on Siglec-F is found to be upregulated across all three models of disease. Expression of Siglec-F and its human paralog Siglec-8 is increased in reactive microglia. Overexpression of Siglec-F and Siglec-8 in vitro drives an endocytic and pyroptotic inflammatory response. In Brief Phosphoproteome signaling changes associated with Alzheimer’s disease (AD) are poorly characterized. Here, Morshed et al. apply phosphoproteomics to mouse models of AD to uncover a novel microglial receptor, Siglec-F, that is upregulated on a subset of inflammatory microglia across models of neurodegeneration. The human paralog, Siglec-8 is also found to be upregulated in late-onset AD microglia. Overexpression of Siglec-F and related human Siglecs activates pro-inflammatory signaling responses in BV-2 cells.

Abstract Cyclin dependent kinase 5 (Cdk5) regulates various developmental and physiological processes in the central nervous system. Deregulation of Cdk5 activity in neurons induces severe neurodegeneration and has been implicated in Alzheimer’s disease (AD) and other neurodegenerative conditions. A large fraction of AD risk genes are highly expressed in microglia, highlighting an important role for these cells in AD pathogenesis. While Cdk5 function in neurons is well characterized, our understanding of its roles in microglial function under physiological and neurodegenerative conditions remain rudimentary. Here, we investigate the roles of Cdk5 in microglia using myeloid-specific Cdk5 conditional knockout mice. Using microglia-specific transcriptome profiling, histological analyses, and behavioral assessments, we found that knockout of Cdk5 in microglia for 1 month induced transcriptional changes characterized by upregulation of cell cycle processes and type I interferon signaling genes in both physiological conditions and AD-related amyloidogenesis. In contrast to the robust transcriptional changes, conditional loss of microglial Cdk5 produced minimal effects on the density and morphology of microglia and their phagocytic activity toward myelin debris. Moreover, Cdk5cKO mice exhibited little change in synaptic density and tasks associated with locomotor, anxiety-like, and memory-related behaviors. Our findings indicate that the conditional loss of Cdk5 in microglia induces rapid alterations of microglial transcriptome with minimal or delayed effects on histological and behavioral responses.