Abstract Our previous work had demonstrated that two commonly used fluorescent dyes that were accumulated by wild-type E. coli MG1655 were accumulated differentially in single-gene knockout strains, and also that they might be used as surrogates in flow cytometric transporter assays. We summarise the desirable properties of such stains, and here survey 143 candidate dyes. We triage them eventually (on the basis of signal, accumulation levels, and cost) to a palette of 39 commercially available and affordable fluorophores that are accumulated significantly by wild-type cells of the ‘Keio’ strain BW25113, as measured flow cytometrically. Cheminformatic analyses indicate both their similarities and their (much more considerable) structural differences. We describe the effects of pH and of the efflux pump inhibitor chlorpromazine on the accumulation. Even the ‘wild-type’ MG1655 and BW25113 strains can differ significantly in their ability to take up such dyes. We illustrate the highly differential uptake of our dyes into strains with particular lesions in, or overexpressed levels of, three particular transporters or transporter components ( yhjV, yihN , and tolC ). The relatively small collection of dyes described offers a rapid, inexpensive, convenient and valuable approach to the assessment of microbial physiology and transporter function.

Abstract We used high-throughput flow cytometry to assess the ability of individual gene knockout strains of E coli to take up two membrane-permeable, cationic fluorescent dyes, viz the carbocyanine diS-C3(5) and the DNA dye SYBR Green. Individual strains showed a large range of distributions of uptake. The range of modal steady-state uptakes for the carbocyanine between the different strains was 36-fold. Knockouts of the ATP synthase α- and β-subunits greatly inhibited uptake, implying that most uptake was ATP-driven rather than being driven by say a membrane potential. Dozens of transporters changed the steady-state uptake of the dye by more than 50% with respect to that of the wild type, in both directions (increased or decreased); knockouts in known influx and efflux transporters behaved as expected, giving confidence in the general strategy. Many of the knockouts with the most reduced uptake were transporter genes of unknown function (‘y-genes’). Similarly, several overexpression variants in the ‘ASKA’ collection had the anticipated, opposite effects. Similar findings were made with SYBR Green (the range being some 69-fold), though despite it too containing a benzimidazole motif there was negligible correlation between its uptake and that of the carbocyanine when compared across the various strains. Overall, we conclude that the uptake of these dyes may be catalysed by a great many transporters of possibly broad and presently unknown specificity. This casts serious doubt upon the use of such dyes as quantitative stains for representing either bioenergetic parameters or the amount of cellular DNA in unfixed cells ( in vivo ). By contrast, it opens up their potential use as transporter assay substrates in high-throughput screening.

Cells of E. coli were grown in LB medium, taken from a stationary phase of 2-4h, and reinoculated into fresh media at a concentration (105.mL-1 or lower) characteristic of bacteriuria. Flow cytometry was used to assess how quickly we could detect changes in cell size, number, membrane energisation (using a carbocyanine dye) and DNA distribution. It turned out that while the lag phase observable macroscopically via bulk OD measurements could be as long as 4h, the true lag phase could be less than 15-20 min, and was accompanied by many observable biochemical changes. Antibiotics to which the cells were sensitive affected these changes within 20 min of reinoculation, providing the possibility of a very rapid antibiotic susceptibility test, on a timescale compatible with a visit to a GP clinic. The strategy was applied successfully to genuine potential Urinary Tract Infection (UTI) samples taken from a doctor′s surgery. The methods developed could prove of considerable value in ensuring the correct prescription and thereby lowering the spread of antimicrobial resistance.