Abstract Background and Purpose G-protein biased μ-opioid agonists against β-arrestin-2 activation are being investigated to reduce adverse effects. While opioid tolerance is strongly linked to the development of dependence, there is a dissociation between the two phenomena in the gut as tolerance does not develop to opioid-induced constipation, but diarrhea still manifests upon withdrawal. Here, we investigated the mechanism by which morphine tolerance in the small intestine develops. Experimental Approach Mechanism of morphine tolerance in the small intestine was evaluated in vivo and at the neuronal level. Whole-cell patch clamp electrophysiology was used to investigate tolerance in individual ileum myenteric neurons. Rate of morphine tolerance development in the small intestine was assessed against peripheral antinociception and whole gut transit. Key Results Tolerance develops to inhibition of small intestinal motility after one day of morphine exposure, and is more rapid compared to peripheral antinociception and constipation in chronic morphine-treated mice. Morphine tolerance was reversed by the PKC inhibitor, Tamoxifen, but not by β-arrestin-2 deletion. Similarly, β-arrestin-2 deletion did not prevent morphine tolerance to inhibition of neuronal excitability in ileum myenteric neurons. However, neuronal tolerance was attenuated by inhibiting PKC. Conclusions and Implications Unlike antinociceptive tolerance, rapid morphine tolerance in the small intestine is independent of β-arrestin-2 but is PKC-mediated. These findings reveal a potential mechanism for differences in the rates of tolerances to opioids, implicate myenteric neurons of the ileum as the primary cause for opioid-induced withdrawal effects and suggest that undesired gastrointestinal effects will persist with biased opioid agonist use. Summary What is already known: Tolerance does not develop to chronic-opioid-induced constipation but diarrhea is produced upon withdrawal Novel G-protein biased agonists that preclude β-arrestin-2 activation at the μ-opioid receptor are in development What this study adds: Morphine tolerance in the ileum develops systemically and in individual myenteric neurons independent of β-arrestin-2 Morphine tolerance in the small intestine develops before antinociception and is reversed by PKC inhibition Clinical significance: Clinical use of G-protein biased opioid agonists will not prevent tolerance development in the ileum Tolerance in ileum myenteric neurons might be the basis of opioid-induced withdrawal in the gut