Dysregulated mitophagy has been linked to Parkinson's disease (PD) due to the role of PTEN-induced kinase 1 (PINK1) in mediating depolarization-induced mitophagy in vitro. Elegant mouse reporters have revealed the pervasive nature of basal mitophagy in vivo, yet the role of PINK1 and tissue metabolic context remains unknown. Using mito-QC, we investigated the contribution of PINK1 to mitophagy in metabolically active tissues. We observed a high degree of mitophagy in neural cells, including PD-relevant mesencephalic dopaminergic neurons and microglia. In all tissues apart from pancreatic islets, loss of Pink1 did not influence basal mitophagy, despite disrupting depolarization-induced Parkin activation. Our findings provide the first in vivo evidence that PINK1 is detectable at basal levels and that basal mammalian mitophagy occurs independently of PINK1. This suggests multiple, yet-to-be-discovered pathways orchestrating mammalian mitochondrial integrity in a context-dependent fashion, and this has profound implications for our molecular understanding of vertebrate mitophagy.

Abstract In Alzheimer disease, Tau pathology is thought to propagate from cell to cell throughout interconnected brain areas. However, the forms of Tau released into the brain interstitial fluid (ISF) in vivo during the development of Tauopathy and their pathological relevance remain unclear. Combining in vivo microdialysis and biochemical analysis, we find that in Tau transgenic mice, human Tau (hTau) present in brain ISF is truncated and comprises at least 10 distinct fragments spanning the entire Tau protein. The fragmentation pattern is similar across different Tau transgenic models, pathological stages and brain areas. ISF hTau concentration decreases during Tauopathy progression, while its phosphorylation increases. ISF from mice with established Tauopathy induces Tau aggregation in HEK293-Tau biosensor cells. Notably, immunodepletion of ISF phosphorylated Tau, but not Tau fragments, significantly reduces its ability to seed Tau aggregation and only a fraction of Tau, separated by ultracentrifugation, is seeding competent. These results indicate that ISF seeding competence is driven by a small subset of Tau, which potentially contribute to the propagation of Tau pathology. Highlights In interstitial fluid (ISF) of transgenic mice, Tau comprises >10 distinct fragments ISF Tau decreases with Tauopathy progression, while its phosphorylation increases Only ISF from mice with established Tauopathy is seeding competent in vitro Removal of phospho-Tau reduces ISF seeding competence ISF seeding competence is driven by less soluble, aggregated and phosphorylated Tau Graphical abstract

SUMMARY Autosomal recessive mutations in PINK1 and Parkin cause Parkinson’s disease. How activation of PINK1 and Parkin leads to elimination of damaged mitochondria by mitophagy is largely based on cell culture studies with few molecular studies in neurons. Herein we have undertaken a global proteomic-analysis of mitochondria from mouse neurons to identify ubiquitylated substrates of endogenous Parkin activation. Comparative analysis with human iNeuron datasets revealed a subset of 49 PINK1-dependent diGLY sites upregulated upon mitochondrial depolarisation in 22 proteins conserved across mouse and human systems. These proteins were exclusively localised at the mitochondrial outer membrane (MOM) including, CISD1, CPT1α, ACSL1, and FAM213A. We demonstrate that these proteins can be directly ubiquitylated by Parkin in vitro . We also provide evidence for a subset of cytoplasmic proteins recruited to mitochondria that undergo PINK1 and Parkin independent ubiquitylation including SNX3, CAMK2α and CAMK2β indicating the presence of alternate ubiquitin E3 ligase pathways that are activated by mitochondrial depolarisation in neurons. Finally we have developed an online resource to visualise mitochondrial ubiquitin sites in neurons and search for ubiquitin components recruited to mitochondria upon mitochondrial depolarisation, MitoNUb. This analysis will aid in future studies to understand Parkin activation in neuronal subtypes. Our findings also suggest that monitoring ubiquitylation status of the 22 identified MOM proteins may represent robust biomarkers for PINK1 and Parkin activity in vivo .