ABSTRACT Epsins are endocytic adaptor proteins with signaling and endocytic functions. The three mammalian epsin paralogs are made of an Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain and an unstructured C-terminal region. The highly conserved ENTH domain plays a role in signaling by blocking RhoGAP activity and is required for cell migration in mammalian cells. However, our lab has previously shown that only epsin full length overexpression can enhance cell migration, but the ENTH domain alone cannot. Among the three Epsin paralogs, epsin 3 followed by epsin 2 were able to substantially enhance cell migration. This study is the first one to systematically and comprehensibly address the contribution of different motifs within the epsin C-terminus to enhance protein localization and cell migration. We show that is not the lipid-binding ENTH domain, but the C-terminus of epsin the one playing a major role in epsin association with sites of endocytosis. Further, we dissected the contribution of individual C-terminal endocytic (clathrin-, AP2-, Ubiquitin- and EH domain-binding) motifs for epsin localization. We found that while all motifs show a degree of synergism, the clathrin-binding motifs are the most important for epsin localization. Our study also showed that, these motifs (particularly the clathrin binding site) play an important role in sustaining endocytic site dynamics and cell migration.

Abstract Neutrophil migration and activation are essential for defense against pathogens. However, this process may also lead to collateral tissue injury. We used microRNA overexpression as a platform and discovered protein-coding genes that regulate neutrophil migration. Here we show that miR-99 decreased the chemotaxis of zebrafish neutrophils and human neutrophil-like cells. In zebrafish neutrophils, miR-99 directly targets the transcriptional factor RAR-related orphan receptor alpha (roraa) . Inhibiting RORα, but not the closely related RORγ, reduced chemotaxis of zebrafish and primary human neutrophils without causing cell death, and increased susceptibility of zebrafish to bacterial infection. Expressing a dominant-negative form of Rorα or disrupting the roraa locus specifically in zebrafish neutrophils reduced cell migration. At the transcriptional level, RORα regulates transmembrane signaling receptor activity and protein phosphorylation pathways. Our results, therefore, reveal previously unknown functions of miR- 99 and RORα in regulating neutrophil migration and anti-microbial defense.

ABSTRACT Epsins are endocytic adaptor proteins involved in the internalization of important membrane proteins such as EGFR and Notch ligands. Therefore, this protein family impacts critical signaling pathways and processes such as cell migration and cytokinesis and is ultimately required for embryo development in mammals and cell viability in yeast. Intriguingly, although Epsins are conserved and display similar binding determinants, the process of endocytosis in yeast and mammals exhibit some dramatic mechanistic differences. Therefore, we wondered if the function of Epsins in these organisms are similar and are similarly regulated or they also differ. Since proper and timely localization is needed for function, we determined what elements target Epsins to endocytic sites in yeast vs mammals. Specifically, using a systematic/combinatorial mutagenesis approach we produced a collection of yeast and human Epsin mutated variants that was tested for localization at endocytic sites and for function. Our results showed that the intrinsically disordered carboxy-terminus holds the major determinants (involved in binding of ubiquitin, AP2, clathrin and EH domain-containing proteins) for proper intracellular localization of different Epsin paralogs and homologs in yeast and mammals, while also having a major impact on function. Importantly, we established hierarchies of carboxy-terminal binding determinants for sustaining Epsin localization which turned to be different for human vs. yeast cells; favoring clathrin and AP2 binding in the former and recognition of cargo and EH domain-containing proteins for the latter. Further, we found evidence in both systems that yeast Epsins also use for localization regions of the protein that were until now of unknown functional relevance, i.e., glutamine-rich sequences. Interestingly, some molecular determinants within the Epsin molecule seem to have functional importance beyond its contribution to localization to endocytic sites. Based on these findings, we propose working models for Epsin function and recruitment to membranes/endocytic sites at different maturation stages.