IL15, a potent stimulant of CD8(+) T cells and natural killer (NK) cells, is a promising cancer immunotherapeutic. ALT-803 is a complex of an IL15 superagonist mutant and a dimeric IL15 receptor αSu/Fc fusion protein that was found to exhibit enhanced biologic activity in vivo, with a substantially longer serum half-life than recombinant IL15. A single intravenous dose of ALT-803, but not IL15, eliminated well-established tumors and prolonged survival of mice bearing multiple myeloma. In this study, we extended these findings to demonstrate the superior antitumor activity of ALT-803 over IL15 in mice bearing subcutaneous B16F10 melanoma tumors and CT26 colon carcinoma metastases. Tissue biodistribution studies in mice also showed much greater retention of ALT-803 in the lymphoid organs compared with IL15, consistent with its highly potent immunostimulatory and antitumor activities in vivo. Weekly dosing with 1 mg/kg ALT-803 in C57BL/6 mice was well tolerated, yet capable of increasing peripheral blood lymphocyte, neutrophil, and monocyte counts by >8-fold. ALT-803 dose-dependent stimulation of immune cell infiltration into the lymphoid organs was also observed. Similarly, cynomolgus monkeys treated weekly with ALT-803 showed dose-dependent increases of peripheral blood lymphocyte counts, including NK, CD4(+), and CD8(+) memory T-cell subsets. In vitro studies demonstrated ALT-803-mediated stimulation of mouse and human immune cell proliferation and IFNγ production without inducing a broad-based release of other proinflammatory cytokines (i.e., cytokine storm). Based on these results, a weekly dosing regimen of ALT-803 has been implemented in multiple clinical studies to evaluate the dose required for effective immune cell stimulation in humans.

Abstract The integral membrane zinc metalloprotease ZMPSTE24 is important for human health and longevity. ZMPSTE24 performs a key proteolytic step in maturation of prelamin A, the precursor of the nuclear scaffold protein lamin A. Mutations in the genes encoding either prelamin A or ZMPSTE24 that prevent cleavage cause the premature aging disease Hutchinson Gilford Progeria Syndrome (HGPS) and related progeroid disorders. ZMPSTE24 has a novel structure, with seven transmembrane spans that form a large water-filled membrane chamber whose catalytic site faces the chamber interior. Prelamin A is the only known mammalian substrate for ZMPSTE24, however, the basis of this specificity remains unclear. To define the sequence requirements for ZMPSTE24 cleavage, we mutagenized the eight residues flanking the prelamin A scissile bond (TRSY↓LLGN) to all other 19 amino acids, creating a library of 152 variants. We also replaced these eight residues with sequences derived from putative ZMPSTE24 cleavage sites from amphibian, bird, and fish prelamin A. Cleavage of prelamin A variants was assessed using an in vivo yeast assay that provides a sensitive measure of ZMPSTE24 processing efficiency. We found that residues on the C-terminal side of the cleavage site are most sensitive to changes. Consistent with other zinc metalloproteases, including thermolysin, ZMPSTE24 preferred hydrophobic residues at the P1’ position (Leu647), but in addition, showed a similar, albeit muted, pattern at P2’. Our findings begin to define a consensus sequence for ZMPSTE24 that helps to clarify how this physiologically important protease functions and may ultimately lead to identifying additional substrates.

Abstract Background Androgen deprivation therapy (ADT) in prostate cancer (PCa) has been associated with development of insulin resistance. However, the predominant site of insulin resistance remains unclear. Methods The ADT & Metabolism Study was a single‐center, 24‐week, prospective observational study that enrolled ADT‐naive men without diabetes who were starting ADT for at least 24 weeks (ADT group, n = 42). The control group comprised men without diabetes with prior history of PCa who were in remission after prostatectomy (non‐ADT group, n = 23). Prevalent diabetes mellitus was excluded in both groups using all three laboratory criteria defined in the American Diabetes Association guidelines. All participants were eugonadal at enrollment. The primary outcome was to elucidate the predominant site of insulin resistance (liver or skeletal muscle). Secondary outcomes included assessments of body composition, and hepatic and intramyocellular fat. Outcomes were assessed at baseline, 12, and 24 weeks. Results At 24 weeks, there was no change in hepatic (1.2; 95% confidence interval [CI], −2.10 to 4.43; p = .47) or skeletal muscle (−3.2; 95% CI, −7.07 to 0.66; p = .10) insulin resistance in the ADT group. No increase in hepatic or intramyocellular fat deposition or worsening of glucose was seen. These changes were mirrored by those observed in the non‐ADT group. Men undergoing ADT gained 3.7 kg of fat mass. Conclusions In men with PCa and no diabetes, 24 weeks of ADT did not change insulin resistance despite adverse body composition changes. These findings should be reassuring for treating physicians and for patients who are being considered for short‐term ADT.

Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status (PS) is a key clinical variable for cancer treatment and research, but it is usually only recorded in unstructured form in the electronic health record. We investigated whether natural language processing (NLP) models can impute ECOG PS using unstructured note text.

4515 Background: RCC is notable for a high CD8+ T cell infiltration despite its modest tumor mutational load. However, CD8+ T cell infiltration does not correlate with ICI response, highlighting the need to understand cellular composition and phenotype. We conducted a comprehensive dissection of the tumor microenvironment (TME) using pre- and post-ICI treatment samples to identify specific T-cell populations associated with ICI treatment efficacy in RCC. Methods: A total of 70 tumor samples (n = 59 clear cell; n = 11 non-clear cell) from 63 patients with RCC were collected before (n = 48) and/or after (n = 22) systemic therapies (VEGFi, n = 9; mono-ICI, n = 20; ICI + ICI, n = 17; ICI + VEGFi, n = 9; others, n = 15). This cohort contained 12 paired samples on pre and post from 5 patients, and 58 unpaired samples. Responders (R) were defined as complete and partial responses (n = 22), and non-responders (NR) as disease progression (n = 33) according to the best response based on RECIST. We performed single-cell RNA-sequence (scRNA-seq) on all samples and established a transcriptomics atlas in RCC. We utilized established gene expression signatures to interrogate cellular composition and functional states for samples from ICI-treated patients. We used non-negative matrix factorization (NMF) to identify gene programs, offering superior feature preservation and interpretability. Results: 443,337 high-quality viable cells were annotated to lymphoid, myeloid, tumor, endothelial, or fibroblast compartments, capturing the RCC TME landscape. Among CD8+ T cells, we observed significant heterogeneity, particularly in exhausted T cells (Tex) expressing PD-1 and TIM-3. Tex in NR showed enrichment for tissue-residency and innate-like genes and gene programs, exemplified by significant upregulation of ZNF683 (p = 0.031) and ITGAE (p = 0.0041). In contrast, Tex in R exhibited a marked upregulation of heat shock protein genes, such as HSP1B (p < 2.22E-16) and DNAJB1 (p < 2.22E-16), highlighting a distinct genomic profile. Notably, through NMF analysis, Tex in R showed a significantly higher stress response program and terminal exhaustion program than in NR at baseline and after ICI treatment. Further analysis through gene signature scoring showed an association between Tex in R and enhanced IFN and chemokine activities, stress response, and terminal differentiation post-ICI. Conclusions: Our single-cell transcriptomic analysis uncovered the relationship between Tex with active stress responses and ICI efficacy, additional suggesting T cell revival with ICI-exposure. This study identifies the specific Tex characteristics associated with ICI responsiveness, highlighting scRNA-seq as a scientific strategy for deep correlative analysis in large patient cohorts, and emphasizing the need for further investigation into the unique intricacies of the RCC TME.

Abstract The integral membrane zinc metalloprotease ZMPSTE24 plays a key role in the proteolytic processing of farnesylated prelamin A, the precursor of the nuclear scaffold protein lamin A. Failure of this processing step results in the accumulation of permanently farnesylated forms of prelamin A which cause the premature aging disease Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS), as well as related progeroid disorders, and may also play a role in physiological aging. ZMPSTE24 is an intriguing and unusual protease because its active site is located inside of a closed intramembrane chamber formed by seven transmembrane spans with side portals in the chamber permitting substrate entry. The specific features of prelamin A that make it the sole known substrate for ZMPSTE24 in mammalian cells are not well-defined. At the outset of this work it was known that farnesylation is essential for prelamin A cleavage in vivo and that the C-terminal region of prelamin A (41 amino acids) is sufficient for recognition and processing. Here we investigated additional features of prelamin A that are required for cleavage by ZMPSTE24 using a well-established humanized yeast system. We analyzed the 14-residue C-terminal region of prelamin A that lies between the ZMPSTE24 cleavage site and the farnesylated cysteine, as well 23-residue region N-terminal to the cleavage site, by generating a series of alanine substitutions, alanine additions, and deletions in prelamin A. Surprisingly, we found that there is considerable flexibility in specific requirements for the length and composition of these regions. We discuss how this flexibility can be reconciled with ZMPSTE24’s selectivity for prelamin A.