Abstract In this study, we report a novel biological function of vitamin A metabolites in conversion of naive FoxP3− CD4+ T cells into a unique FoxP3+ regulatory T cell subset (termed “retinoid-induced FoxP3+ T cells”) in both human and mouse T cells. We found that the major vitamin A metabolite all-trans-retinoic acid induces histone acetylation at the FoxP3 gene promoter and expression of the FoxP3 protein in CD4+ T cells. The induction of retinoid-induced FoxP3+ T cells is mediated by the nuclear retinoic acid receptor α and involves T cell activation driven by mucosal dendritic cells and costimulation through CD28. Retinoic acid can promote TGF-β1-dependent generation of FoxP3+ regulatory T cells but decrease the TGF-β1- and IL-6-dependent generation of inflammatory Th17 cells in mouse T cells. Retinoid-induced FoxP3+ T cells can efficiently suppress target cells and, thus, have a regulatory function typical for FoxP3+ T cells. A unique cellular feature of these regulatory T cells is their high expression of gut-homing receptors that are important for migration to the mucosal tissues particularly the small intestine. Taken together, these results identify retinoids as positive regulatory factors for generation of gut-homing FoxP3+ T cells.

ABSTRACT Objective RNA helicase DDX5 is downregulated during hepatitis B virus (HBV) replication, and poor prognosis HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC). The objective of this study is to understand the significance of DDX5 downregulation during HBV infection and poor prognosis HCC, as it pertains to therapy of chronically HBV-infected patients with HCC. IFN-α therapy is effective only for a subgroup of HBV-infected patients, for reasons not understood. Herein, we investigated a novel mechanism of STAT1 translational control, involving DDX5-mediated resolution of a G-quadruplex structure, located at the 5’UTR of STAT1 mRNA, enabling STAT1 translation. Design and Results Molecular, pharmacologic, and biophysical assays were used together with cellular model of HBV replication, HCC cell lines, and HBV-related liver tumors. We observed, the protein level of DDX5 correlated with that of transcription factor STAT1. We show, DDX5 regulates STAT1 mRNA translation by resolving a G-quadruplex (rG4) RNA structure, proximal to the 5’ end of STAT1 5’UTR. We employed luciferase reporter assays comparing wild type (WT) vs . mutant (MT) rG4 sequence, rG4-stabilizing compounds, CRISPR/Cas9 editing of the rG4 sequence, and circular dichroism determination of rG4 structure. Ribonucleoprotein assays identified direct DDX5 binding to WT but not MT rG4. Importantly, liver cancer cell lines expressing low DDX5 exhibited reduced interferon response, while immunohistochemistry of HBV-related HCCs exhibiting absence of DDX5, also lacked STAT1. Conclusion DDX5 resolves a G-quadruplex structure in 5’UTR of STAT1 mRNA, enabling STAT1 translation. DDX5 is a key regulator of the dynamic range of interferon response during innate immunity and adjuvant IFN-α therapy.

In advanced hepatocellular carcinoma (HCC), RNA helicase DDX5 regulates the Wnt/β-catenin-ferroptosis axis, influencing the efficacy of the multi-tyrosine kinase inhibitor (mTKI) sorafenib. DDX5 inhibits Wnt/β-catenin signaling, preventing sorafenib-induced ferroptosis escape. Sorafenib/mTKIs reduce DDX5 expression, correlating with poor patient survival post-sorafenib treatment. Notably, DDX5-knockout in HCC cells activates Wnt/β-catenin signaling persistently. Herein, we investigate the mechanistic impact of Wnt/β-catenin activation resulting from DDX5 downregulation in the progression and treatment of HCC. RNAseq analyses identified shared genes repressed by DDX5 and upregulated by sorafenib, including Wnt signaling genes, NF-κB-inducing kinase (NIK) essential for non-canonical NF-κB (p52/RelB) activation, and cytoprotective transcription factor NRF2. We demonstrate, Wnt/β-catenin activation induced NIK transcription, leading to non-canonical NF-κB activation, which subsequently mediated NRF2 transcription. Additionally, DDX5 deficiency extended NRF2 protein half-life by inactivating KEAP1 through p62/SQSTM1 stabilization. In a preclinical HCC mouse model, NRF2 knockdown or DDX5 overexpression restricted tumor growth upon sorafenib treatment, via induction of ferroptosis. Importantly, DDX5-knockout HCC cells exhibited elevated expression of Wnt signaling genes, NIK, p52/RelB, and NRF2-regulated genes, regardless of sorafenib treatment. Transcriptomic analyses of HCCs from TCGA and the Stelic Animal Model (STAM) of non-alcoholic steatohepatitis revealed elevated expression of these interconnected pathways in the context of DDX5 downregulation. In conclusion, DDX5 deficiency triggers Wnt/β-catenin signaling, promoting p52/RelB and NRF2 activation, thereby enabling ferroptosis evasion upon sorafenib treatment. Similarly, independent of sorafenib, DDX5 deficiency in liver tumors enhances activation and gene expression of these interconnected pathways, underscoring the clinical relevance of DDX5 deficiency in HCC progression and therapeutic response.

Background and Aims: RNA helicase DEAD box protein 5 (DDX5) is downregulated during hepatitis B virus (HBV) replication, and associates with poor prognosis HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC). The aim of this study is to determine the mechanism and significance of DDX5 downregulation for HBV-driven HCC. Approach & Results: We used established cellular models of HBV replication, HBV infection, as well as HBV-related liver tumors. HBV replicating DDX5 knockdown hepatocytes were analyzed by RNAseq; differentially expressed genes were validated by qRT-PCR, and bioinformatic analyses of HCCs from The Cancer Genome Atlas. Our results show reduced expression of DDX5 in HCCs of all etiologies is associated with poor survival. In HBV replicating hepatocytes, downregulation of DDX5 is mediated by miR17~92 and miR106b~25, induced by HBV infection. Increased expression of these miRNAs was quantified in HBV-associated HCCs expressing a hepatic cancer stem cell (hCSC)-like gene signature and reduced DDX5 mRNA, suggesting a role for DDX5 in hCSC formation. Interestingly, DDX5 knockdown in HBV replicating hepatocyte cell lines resulted in hepatosphere formation, sorafenib and cisplatin resistance, Wnt signaling activation and pluripotency gene expression, all characteristics of hCSCs. Moreover, DDX5 knockdown increased viral replication. RNA-seq analyses of HBV-replicating DDX5 knockdown cells, identified enhanced expression of key genes of the Wnt/β-catenin pathway, including Frizzled7 (FZD7) and Matrix Metallopeptidase7 (MMP7), indicative of Wnt signaling activation. Clinically, elevated FZD7 expression correlates with poor patient survival. Importantly, inhibitors to miR17~92 and miR106b~25 restored DDX5 levels and suppressed both Wnt/β-catenin activation and viral replication. Conclusion: DDX5 is a negative regulator of Wnt signaling and hepatocyte reprogramming in HCCs. Restoration of DDX5 levels in HBV-infected patients can exert both antitumor and antiviral effects.

Objective: To determine the role of RNA helicase DDX5 in sorafenib/multi-tyrosine kinase inhibitor (mTKI) response. Sorafenib and mTKIs downregulate DDX5 in vitro and preclinical hepatocellular carcinoma (HCC) models. In turn, sorafenib-mediated DDX5 downregulation activates Wnt/β-catenin and non-canonical NF-κB signaling, resulting in ferroptosis escape and mTKI resistance. Design and Results: Molecular, pharmacologic and bioinformatic approaches were employed in human HCC cell lines, preclinical HCC models, and HCCs from TCGA. Earlier studies linked sorafenib effectiveness to ferroptosis. Herein we demonstrate sorafenib/mTKIs downregulate DDX5 in vitro and in vivo. To understand the effect of DDX5 downregulation, we compared TCGA-derived HCCs expressing low vs. high DDX5 focusing on ferroptosis-related genes. Glutathione Peroxidase 4 (GPX4), a key ferroptosis regulator, was significantly overexpressed in DDX5LOW HCCs. Importantly, DDX5-knockdown (DDX5KD) HCC cell lines lacked lipid peroxidation by GPX4 inhibition, indicating DDX5 downregulation suppresses ferroptosis. RNAseq of wild type vs. DDX5KD cells untreated or treated with sorafenib, identified a unique set of genes repressed by DDX5 and upregulated by sorafenib. This set significantly overlaps genes from Wnt/β-catenin and non-canonical NF-κB pathways, including NF-κB inducing Kinase required for non-canonical NF-κB activation. Pharmacologic inhibition of these pathways in combination with sorafenib reduced DDX5KD cell viability. Mechanistically, sorafenib-mediated NIK expression induced NRF2 transcription, while DDX5KD extended NRF2 half/life by stabilizing p62/SQSTM1, enhancing GPX4 expression and ferroptosis escape. Conclusion: Sorafenib/mTKI-mediated DDX5 downregulation results in adaptive mTKI resistance by enhancing NRF2 expression, leading to ferroptosis escape. We propose inhibition of the pathways leading to NRF2 expression will enhance the therapeutic effectiveness of sorafenib/mTKIs.