Summary Bacteria are often thought of as having two dormant phenotypes: the viable but non‐culturable (VBNC) state and the persister state. Here we investigate the relatedness of the two stress‐induced phenotypes at the single‐cell level and examine cell morphology and quantify cell resuscitation. Using the classic starvation conditions to create VBNC cells, we found that the majority of the remaining Escherichia coli population are spherical, have empty cytosol and fail to resuscitate; however, some of the spherical cells resuscitate immediately (most probably those with dense cytosol). Critically, all the culturable cells in this starved population became persister cells within 14 days of starvation. We found that the persister cells initially are rod‐like, have clear but limited membrane damage, can resuscitate immediately and gradually become spherical by aging. After 24 h, only rod‐shaped persister cells survive, and all the spherical cells lyse. Both cell populations formed under the VBNC‐inducing conditions and the persister conditions are metabolically inactive. Therefore, the bacterial population consists of dead cells and persister cells in the VBNC‐inducing conditions; that is, the non‐lysed particles that do not resuscitate are dead, and the dormant cells that resuscitate are persister cells. Hence, ‘VBNC’ and ‘persister’ describe the same dormant phenotype.

ABSTRACT We determined previously that some cryptic prophages are not genomic junk but instead enable cells to combat myriad stresses as part of an active stress response. However, how these phage fossils affect the extreme stress response of dormancy; i.e., how cryptic prophages affect persister cell formation and resuscitation, has not been fully explored. Persister cells form as a result of stresses such as starvation, antibiotics, and oxidative conditions, and resuscitation of these persister cells likely causes recurring infections such as those associated with tuberculosis, cystic fibrosis, and Lyme disease. Unlike for the active stress response, here we find that deletion of each of the nine Escherichia coli cryptic prophages has no effect on persister cell formation. Strikingly, elimination of each cryptic prophage results in an increase in persister cell resuscitation with a dramatic increase in resuscitation upon deleting all nine prophages. This increased resuscitation includes eliminating the need for a carbon source and is due to activation of the phosphate import system as a result of inactivating transcriptional regulator AlpA of the CP4-57 cryptic prophage, since we found Δ alpA increases persister resuscitation, and AlpA represses phosphate regulator PhoR. Therefore, we report a novel cellular stress mechanism controlled by cryptic prophages: regulation of phosphate uptake which controls the exit of the cell from dormancy and prevents premature resuscitation in the absence of nutrients.

Persistence, the stress-tolerant state, is arguably the most vital phenotype since nearly all cells experience nutrient stress, which causes a sub-population to become dormant. However, how persister cells wake to reconstitute infections is not understood well. Here, using single-cell observations, we determined that Escherichia coli persister cells resuscitate primarily when presented with specific carbon sources, rather than spontaneously. In addition, we found that the mechanism of persister cell waking is through sensing nutrients by chemotaxis and phosphotransferase membrane proteins. Furthermore, nutrient transport reduces the level of secondary messenger cAMP through enzyme IIA; this reduction in cAMP levels leads to ribosome resuscitation and rescue. Resuscitating cells also immediately commence chemotaxis toward nutrients, although flagellar motion is not required for waking. Hence, persister cells wake by perceiving nutrients via membrane receptors which relay the signal to ribosomes via the secondary messenger cAMP, and persisters wake and utilize chemotaxis to acquire nutrients.

Aims: Persister cells are stressed cells that have transient tolerance to antibiotics; these cells undergo no genetic change, but instead, their tolerance is due to reduced metabolism. Unfortunately, little is known about how persisters resuscitate, so we explored the waking of a cells in the presence of the interkingdom signal indole. Methods and Results: To generate a large population of persister cells, we induced the persister phenotype in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa by pre-treating cells with carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone to reduce translation by depleting ATP levels, and found, via single cell observations, that proline is sufficient to wake the persister cells. P. aeruginosa is often present in the gastrointestinal tract, and indole from commensal bacteria such as Escherichia coli has been shown to inhibit P. aeruginosa quorum sensing and pathogenicity without influencing growth. Furthermore, indole is not toxic to P. aeruginosa persister cells. However, we find here that physiological concentrations of indole inhibit P. aeruginosa persister cell resuscitation with an efficiency of higher than 95%. Critically, when contacted with E. coli stationary phase cultures, the indole produced by E. coli completely inhibits persister cell resuscitation of P. aeruginosa. Conclusions: Therefore, E. col has devised a method to outcompete its competitors by preventing their resuscitation with indole. Significance: This work provides insight into why indole is produced by commensal bacteria.

ABSTRACT Osteoclasts derived from hematopoietic stem cells express immunoreceptors on their cell surface. Previously, we showed that the β‐glucan curdlan suppressed osteoclastogenesis via binding to dectin‐1, a pattern recognition receptor. Curdlan negatively regulates osteoclast differentiation and bone resorption capacity by suppressing the expression of nuclear factor of activated T cells 1 (NFATc1), a master factor for osteoclast differentiation, in a dectin‐1‐dependent manner; however, the mechanism involved in this process has not yet been fully elucidated. In this study, we aimed to elucidate the molecular mechanism involved in the suppression of RANKL‐induced osteoclast differentiation by curdlan. Real‐time RT‐qPCR results showed that curdlan suppressed the expression of NFATc1 in cells of the osteoclast progenitor cell line RAW264.7 overexpressing dectin‐1 (d‐RAW cells), without altering the expression of negative regulators. Therefore, we examined the effect of curdlan on the NF‐κB pathway, which is important for the induction of NFATc1 expression. Western blot analysis results showed that curdlan addition suppressed RANKL‐induced NF‐κB activation in the vector control line (c‐RAW) cells with low expression of dectin‐1, in d‐RAW cells, and the parental RAW264.7 (RAW) cells. The results of tartrate‐resistant alkaline phosphatase staining and real‐time RT‐qPCR showed that curdlan addition suppressed osteoclast differentiation in RAW cells, suggesting the presence of a dectin‐1‐independent modification system. Finally, we focused on the complement receptor 3 (CR3), which binds β‐glucan, and revealed that blocking the binding of β‐glucan to the CD11b molecule, a component of CR3, by neutralizing antibody, recovered the suppression of IκBα degradation by curdlan. These results suggest that the suppression of osteoclast differentiation by curdlan involves not only the dectin‐1‐dependent pathway but also the negative regulation of NFATc1 via modification of the NF‐κB pathway via CR3 recognition. The results of this study may aid to establish treatment methods for metabolic bone diseases and inflammatory bone destruction and to clarify their pathogenesis.

Background: Streptococcus sanguinis is a leading cause of infective endocarditis (IE), which causes diverse clinical symptoms and even death. Recurrence after treatment is a crucial problem in IE, possibly caused by the presence of "persister" cells, a small bacterial population that can survive antimicrobials. In this study, the residual risk for penicillin G (PCG) and gentamicin (GM), used for treating IE, to induce Streptococcus sanguinis persisters, was investigated. Methods: The bactericidal effects of PCG and GM on S. sanguinis were evaluated. Furthermore, we confirmed whether the S. sanguinis that survived following combination treatment with PCG and GM were persisters. The bactericidal effect of the combination of PCG and GM against S. sanguinis was measured after the addition of glucose or arginine. Results: Following 48 h of treatment with PCG (1600 μg/mL) and GM (64 μg/mL), S. sanguinis survived, albeit with a low bacterial count, indicating the presence of persisters. The addition of glucose or arginine to PCG and GM increased the bactericidal effect on residual persister cells and reduced the number of persister cells. Moreover, the addition of glucose at concentrations of 10 mg/mL or higher was substantially effective in achieving sterilization. Conclusions: Our findings demonstrate that persisters of S. sanguinis that survive antimicrobial treatment may make the treatment of IE challenging, and that combining antimicrobial treatment with glucose is effective for eliminating persisters of S. sanguinis. Taken together, these findings may facilitate the development of novel therapeutic strategies against IE caused by oral streptococcal infection.