SUMMARY Pyruvate kinase (PK) and the phosphoenolpyruvate (PEP) cycle play key roles in nutrient-stimulated K ATP channel closure and insulin secretion. To identify the PK isoforms involved, we generated mice lacking β-cell PKm1, PKm2, and mitochondrial PEP carboxykinase (PCK2) that generates mitochondrial PEP. Glucose metabolism generates both glycolytic and mitochondrially-derived PEP, which triggers K ATP closure through local PKm1 and PKm2 signaling at the plasma membrane. Amino acids, which generate mitochondrial PEP without producing glycolytic fructose 1,6-bisphosphate to allosterically activate PKm2, signal through PKm1 to raise ATP/ADP, close K ATP channels, and stimulate insulin secretion. Raising cytosolic ATP/ADP with amino acids is insufficient to close K ATP channels in the absence of PK activity or PCK2, indicating that K ATP channels are regulated by mitochondrially-derived PEP that provides ATP via plasma membrane-associated PK, but not via mitochondrially-derived ATP. Following membrane depolarization, the PEP cycle is also involved in an “off-switch” that facilitates K ATP channel reopening and Ca 2+ extrusion, as shown by PK activation experiments and β-cell PCK2 deletion that prolonged Ca 2+ oscillations and increased insulin secretion. In conclusion, the differential response of PKm1 and PKm2 to the glycolytic and mitochondrial sources of PEP influences the β-cell nutrient response, and controls the oscillatory cycle regulating insulin secretion.

The spatial architecture of the islets of Langerhans is hypothesized to facilitate synchronized insulin secretion between β cells, yet testing this in vivo in the intact pancreas is challenging. Robo βKO mice, in which the genes Robo1 and Robo2 are deleted selectively in β cells, provide a unique model of altered islet architecture without loss of β cell differentiation or islet damage from diabetes. Combining Robo βKO mice with intravital microscopy, we show here that Robo βKO islets lose synchronized intra-islet Ca2+ oscillations between β cells in vivo. We provide evidence that this loss is not due to a β cell-intrinsic function of Robo, loss of Connexin36 gap junctions, or changes in islet vascularization, suggesting that the islet architecture itself is required for synchronized Ca2+ oscillations. These results will have implications for understanding structure-function relationships in the islets during progression to diabetes as well as engineering islets from stem cells.

ABSTRACT Of the β-cell signaling pathways altered by non-diabetic obesity and insulin resistance, some are adaptive while others actively contribute to β-cell failure and demise. Cytoplasmic calcium (Ca 2+ ) and cyclic AMP (cAMP), which control the timing and amplitude of insulin secretion, are two important signaling intermediates that can be controlled by stimulatory and inhibitory G protein-coupled receptors. Previous work has shown the importance of the cAMP-inhibitory EP3 receptor in the beta-cell dysfunction of type 2 diabetes. To examine alterations in β-cell cAMP during diabetes progression we utilized a β-cell specific cAMP biosensor in tandem with islet Ca 2+ recordings and insulin secretion assays. Three groups of C57BL/6J mice were used as a model of the progression from metabolic health to type 2 diabetes: wildtype, normoglycemic Leptin Ob , and hyperglycemic Leptin Ob . Here, we report robust increases in β-cell cAMP and insulin secretion responses in normoglycemic Leptin ob mice as compared to wild-type: an effect that was lost in islets from hyperglycemic Leptin ob mice, despite elevated Ca 2+ duty cycle. Yet, the correlation of EP3 expression and activity to reduce cAMP levels and Ca 2+ duty cycle with reduced insulin secretion only held true in hyperglycemic Leptin Ob mice. Our results suggest alterations in beta-cell EP3 signaling may be both adaptive and maladaptive and define β-cell EP3 signaling as much more nuanced than previously understood.

Diabetes is associated with insulin insufficiency arising from a loss of β-cell function and mass. Disinhibited glucagon secretion, arising from the loss of β-cells, is thought to be responsible for as much as half of hyperglycemia in diabetes. An alternative possibility is that increased glucagon release from α-cells is an adaptive mechanism essential to preserving β-cell function in response to the loss of β-cell mass. To study islet compensation in response to β-cell mass deficiency, we used CRISPR to generate a novel strain of β-cell replication deficient (βRD) mice (Cdk1f/f:Ucn3-Cre). We examined in vivo and ex vivo glucagon and insulin secretion in response to β-cell and α-cell stimuli, performed scRNA-seq on isolated islets, and utilized cAMP and Ca2+ biosensors to test the impact of α-cell paracrine signaling on β-cell function. In the setting of reduced β-cell mass, adult βRD mice exhibited glucose intolerance and reduced insulin secretion that was rescued by α-cell engagement with a mixed meal or intraperitoneal alanine. ScRNA-seq revealed rewiring of α-cell metabolic and secretory genes in isolated βRD islets, and glucagon secretion was increased both in vivo and ex vivo. Correspondingly, antagonism of GLP-1 and glucagon receptors resulted in defective glucose-stimulated insulin secretion in βRD islets, which was otherwise equivalent to controls, indicating that α-cell signaling is necessary to preserve β-cell function in the βRD islets. β-cell cAMP was upregulated in β-cells from βRD islets, and Ca2+ oscillations activated at lower levels of glucose than controls, suggesting that β-cell cAMP production is a key mechanism of compensation. Our results suggest that increased glucagon secretion is initially an adaptive compensation for β-cell mass deficiency. Understanding islet reprogramming under physiological and pathophysiological circumstances could accelerate development of novel therapeutics to ameliorate α and β-cell dysfunction in diabetes. Disclosure H.R. Foster: None. S. Sdao: None. M. Adams: Employee; Genentech, Inc. B. Blum: None. M.J. Merrins: None. Funding National Institutes of Health (RO1DK113103, T32AG000213, R01AG062328, R01DK127637); U.S. Department of Veterans Affairs (I01BX005113); Health Resources and Services Administration (T32HP10010)