Abstract Excess maternal fat intake and obesity increase offspring susceptibility to conditions such as chronic anxiety and substance abuse. We hypothesised that these susceptibilities are established through environmentally modulated DNA-methylation (5mC/5hmC) changes in regions of the genome that modulate mood and consumptive behaviours. We explored the effects of environmental factors on 5mC/5hmC levels within the GAL5.1 enhancer that controls anxiety-related behaviours and alcohol intake. We first observed that 5mC/5hmC levels within the GAL5.1 enhancer differed significantly in different parts of the brain. Moreover, we noted that early life stress had no significant effect of 5mC/5hmC levels within GAL5.1. By contrast, we identified that allowing access of pregnant mothers to high-fat diet (>60% calories from fat) had a significant effect on 5mC/5hmC levels within GAL5.1 in hypothalamus and amygdala of resulting male offspring. Cell transfection based studies using GAL5.1 reporter plasmids showed that 5mC has a significant repressive effect on GAL5.1 activity and its response to known stimuli such as EGR1 expression and PKC agonism. Intriguingly, CRISPR driven disruption of GAL5.1 from the mouse genome, although having negligible effects on metabolism, significantly decreased intake of high fat diet suggesting that GAL5.1, in addition to being epigenetically modulated by high-fat diet, also actively contributes to the consumption of high-fat diet suggesting its involvement in an environmentally-influenced regulatory-loop. Furthermore, considering that GAL5.1 also controls alcohol preference and anxiety these studies may provide a first glimpse into an epigenetically controlled mechanism that links maternal high-fat diet with transgenerational susceptibility to alcohol abuse and anxiety.

Excessive alcohol intake is associated with 5.9% of global deaths. However, this figure is especially acute in men such that 7.6% of deaths can be attributed to alcohol intake. Previous studies identified a significant interaction between genotypes of the galanin ( GAL) gene with anxiety and alcohol abuse in different male populations but were unable to define a mechanism. To address these issues the current study analysed the human UK Biobank cohort and identified a significant interaction (n=115,865; p =0.0007) between allelic variation (GG or CA genotypes) in the highly conserved human GAL5.1 enhancer, alcohol intake (AUDIT questionnaire scores) and anxiety in men that was consistent with these previous studies. Critically, disruption of GAL5.1 in mice using CRISPR genome editing significantly reduced GAL expression in the amygdala and hypothalamus whilst producing a corresponding reduction in ethanol intake in KO mice. Intriguingly, we also found evidence of reduced anxiety-like behaviour in male GAL5.1KO animals mirroring that seen in humans. Using bioinformatic analysis and co-transfection studies we further identified the EGR1 transcription factor, that is co expressed with GAL in amygdala and hypothalamus, as being important in the protein kinase C (PKC) supported activity of the GG genotype of GAL5.1 but less so in the CA genotype. Our unique study uses a novel combination of human association analysis, CRISPR genome editing in mice, animal behavioural analysis and cell culture studies to identify a highly conserved regulatory mechanism linking anxiety and alcohol intake that might contribute to increased susceptibility to anxiety and alcohol abuse in men.

ABSTRACT Background Ankylosing Spondylitis (AS) is a common form of inflammatory spinal arthritis with a complex aetiology and high heritability, involving more than 100 genetic associations. These include several AS-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs) upstream of RUNX3 , which encodes the multifunctional RUNT-related transcription factor (TF) 3. The lead associated SNP rs6600247 (p= 2.6 x 10 -15 ) lies ~13kb upstream of the RUNX3 promoter adjacent to a c-MYC TF binding-site. The effect of rs6600247 genotype on DNA binding and chromosome looping were investigated by electrophoretic mobility gel shift assays (EMSA), Western blotting-EMSA (WEMSA) and Chromosome Conformation Capture (3C). Results Interrogation of ENCODE published data showed open chromatin in the region overlapping rs6600247 in primary human CD14+ monocytes in contrast to Jurkat T cell line or primary T-cells. The rs6600247 AS-risk allele is predicted to specifically disrupt a c-MYC binding-site. Using a 50bp DNA probe spanning rs6600247 there was consistently less binding to the AS-risk “C” allele of both purified c-MYC protein and nuclear extracts (NE) from monocyte-like U937 cells. WEMSA on U937 NE and purified c-MYC protein confirmed these differences (n=2; p<0.05). 3C experiments demonstrated negligible interaction between the region encompassing rs6600247 and the RUNX3 promoter. A stronger interaction frequency was demonstrated between the RUNX3 promoter and the previously characterised AS-associated SNP rs4648889 . Conclusions The lead SNP rs6600247 , located in an enhancer-like region upstream of the RUNX3 promoter, modulates c-MYC binding. However, the region encompassing rs6600247 has rather limited physical interaction with the promoter of RUNX3 . In contrast a clear chromatin looping event between the region encompassing rs4648889 and the RUNX3 promoter was observed. These data provide further evidence for complexity in the regulatory elements upstream of the RUNX3 promoter and the involvement of RUNX3 transcriptional regulation in AS.