Increasing evidence suggests the crucial role of estrogen in ovarian differentiation of nonmammalian vertebrates including fish. The present study has investigated the plausible role of Foxl2 in ovarian differentiation through transcriptional regulation of aromatase gene, using monosex fry of tilapia. Foxl2 expression is sexually dimorphic, like Cyp19a1, colocalizing with Cyp19a1 and Ad4BP/SF-1 in the stromal cells and interstitial cells in gonads of normal XX and sex-reversed XY fish, before the occurrence of morphological sex differentiation. Under in vitro conditions, Foxl2 binds to the sequence ACAAATA in the promoter region of the Cyp19a1 gene directly through its forkhead domain and activates the transcription of Cyp19a1 with its C terminus. Foxl2 can also interact through the forkhead domain with the ligand-binding domain of Ad4BP/SF-1 to form a heterodimer and enhance the Ad4BP/SF-1 mediated Cyp19a1 transcription. Disruption of endogenous Foxl2 in XX tilapia by overexpression of its dominant negative mutant (M3) induces varying degrees of testicular development with occasional sex reversal from ovary to testis. Such fish display reduced expression of Cyp19a1 as well as a drop in the serum levels of 17beta-estradiol and 11-ketotestosterone. Although the XY fish with wild-type tilapia Foxl2 (tFoxl2) overexpression never exhibited a complete sex reversal, there were significant structural changes, such as tissue degeneration, somatic cell proliferation, and induction of aromatase, with increased serum levels of 17beta-estradiol and 11-ketotestosterone. Altogether, these results suggest that Foxl2 plays a decisive role in the ovarian differentiation of the Nile tilapia by regulating aromatase expression and possibly the entire steroidogenic pathway.

The Nile tilapia, a gonochoristic teleost fish with an XX/XY sex-determining system, provides an excellent model for studying gonadal sex differentiation because genetic all-females and all-males are available. In this study, we used quantitative real-time RT-PCR to determine the precise timing of the gonadal expression of 17 genes thought to be associated with gonadal sex differentiation in vertebrates. Gonads were isolated from all-female and all-male tilapia before (5-15 days after hatching [dah]) and after (25-70 dah) morphological sex differentiation. The transcript of aromatase (cyp19a1a), an enzyme responsible for producing estradiol-17beta, was expressed only in XX gonads at 5 dah, with a marked elevation in expression thereafter. In contrast, mRNA expression of steroid 11beta-hydroxylase (cyp11b2), an enzyme responsible for the synthesis of 11-ketotestosterone (11-KT, a potent androgen in fish), was found in XY gonads from 35 dah only. These results, combined with the presence of transcripts for other steroidogenic enzymes and estrogen receptors in XX gonads at 5-7 dah, are consistent with our earlier suggestion that estradiol-17beta plays a critical role in ovarian differentiation in tilapia, whereas a role for 11-KT in testicular differentiation is questionable. A close relationship between the expression of foxl2, but not nr5a1 (Ad4BP/SF-1), and that of cyp19a1a in XX gonads suggests an important role for Foxl2 in the transcriptional regulation of cyp19a1a. Dmrt1 exhibited a male-specific expression in XY gonads from 6 dah onward, suggesting an important role for Dmrt1 in testicular differentiation. Sox9 and amh (anti-Mullerian hormone) showed a testis-specific expression, being evident only in the later stages of testicular differentiation. It is concluded that the sex-specific expression of foxl2 and cyp19a1a in XX gonads and dmrt1 in XY gonads during early gonadal differentiation (5-6 dah) is critical for undifferentiated gonads to differentiate into either the ovary or testis in the Nile tilapia.

The natural reproductive ecology of freshwater eels remained a mystery even after some of their offshore spawning areas were discovered approximately 100 years ago. In this study, we investigate the spawning ecology of freshwater eels for the first time using collections of eggs, larvae and spawning-condition adults of two species in their shared spawning area in the Pacific. Ovaries of female Japanese eel and giant mottled eel adults were polycyclic, suggesting that freshwater eels can spawn more than once during a spawning season. The first collection of Japanese eel eggs near the West Mariana Ridge where adults and newly hatched larvae were also caught shows that spawning occurs during new moon periods throughout the spawning season. The depths where adults and newly hatched larvae were captured indicate that spawning occurs in shallower layers of 150–200 m and not at great depths. This type of spawning may reduce predation and facilitate reproductive success. Little is known about the reproductive ecology of freshwater eels. In this article, the authors describe the capture of two species of eels together with eggs and newly hatched larvae, and suggest that spawning takes place during the new moon at shallower depths than previously thought.

Abstract We investigated progestin and corticosteroid activation of the progesterone receptor (PR) from elephant shark, a cartilaginous fish belonging to the oldest group of jawed vertebrates. Comparison with human PR provides insights into the evolution of steroid activation of human PR. At 1 nM steroid, elephant shark PR is activated by progesterone, 17-hydroxy-progesterone, 20β-hydroxy-progesterone, 11-deoxycorticosterone (21-hydroxyprogesterone) and 11-deoxycortisol. Human PR, in comparison, is activated at 1 nM steroid, only by progesterone and 11-deoxycorticosterone, indicating increased progestin and corticosteroid specificity during the evolution of human PR. RU486, an important clinical antagonist of human PR, did not inhibit progesterone activation of elephant shark PR. Cys-528 in elephant shark PR corresponds to Gly-722 in human PR, which is essential for RU486 inhibition of human PR. Confirming the importance of Cys-528 in elephant shark PR, RU486 inhibited progesterone activation of the Cys528Gly mutant PR. Compared to wild-type human PR, there was an increase in activation of human Gly722Cys PR by11-deoxycortisol and a decrease in activation by corticosterone, which may have been important in selection for the mutation corresponding to human glycine-722 PR that first evolved in platypus PR, a basal mammal.

Abstract Cartilaginous fishes have various unique physiological features such as cartilaginous skeletons and a urea-based osmoregulation strategy for adaptation to their marine environment. Also, because they are considered a sister group of bony vertebrates, understanding their unique features is important from an evolutionary perspective. However, experimental approaches are limited in cartilaginous fishes. Particularly, genetic engineering, which can analyze gene functions as well as cellular behavior, has not been effectively utilized in cartilaginous fishes. This is partly because their reproductive strategy involves internal fertilization, which results in difficulty in microinjection into fertilized eggs at the early developmental stage. Trials of gene transfer have also been limited both in in vitro cultured cells and in vivo . Here, to identify efficient gene transfer methods in cartilaginous fishes, we examined the effects of various methods both in vitro and in vivo using the cloudy catshark, a candidate model cartilaginous fish species. In all methods, green fluorescent protein (GFP) expression was used to evaluate exogenous gene introduction. First, we established a primary cell culture containing fibroblast-like and epithelial-like cells from cloudy catshark embryos. Using these primary cultured cells, we attempted gene transfection by lipofection, polyethylenimine (PEI), adenovirus, baculovirus and electroporation. Among the methods tested, lipofection, electroporation and baculovirus infection enabled the successful introduction of exogenous genes into primary cultured cells, allowing us to study physiological mechanisms at a single-cell level in culture conditions close to those in a living cartilaginous fish. We also attempted in vivo transfection into cloudy catshark embryos by electroporation and baculovirus infection. Although baculovirus-injected groups did not show GFP fluorescence, electroporation successfully introduced GFP into various tissues including muscle cells. Furthermore, we succeeded in GFP introduction into adult testis by electroporation. The in vitro and in vivo gene introduction methods that worked in this study may identify paths for future genetic manipulation including knockout experiments and cellular linage analysis in cartilaginous fishes.