During an infection, the detection of pathogens is mediated through interactions between pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and pathogen recognition receptors. β-Heptose 1,7-bisphosphate (βHBP), a metabolite of the lipopolysaccharide (LPS) biosynthesis pathway, was recently identified as a PAMP of gram-negative bacteria. It was reported that βHBP sensing leads within minutes to oligomerization of the protein TIFA, a mechanism controlling NF-κB activation and pro-inflammatory gene expression. Here, we compared the ability of chemically synthesized βHBP and Shigella flexneri lysate to induce TIFA oligomerization in epithelial cells. In contrast to lysate, we found that βHBP fails to trigger rapid oligomerization of TIFA. βHBP only induces delayed signaling, suggesting that it has to be processed intracellularly to induce inflammation. By dissecting the LPS biosynthesis pathway with deletion mutants and functional complementation experiments, we show that ADP-D-glycero-β-D-manno-heptose and ADP-L-glycero-β-D-manno-heptose are the bacterial metabolites responsible for rapid TIFA oligomerization, and that they strongly induce interleukin-8 expression during S. flexneri infection. Altogether, our results rule out a major role of βHBP in S. flexneri infection and identify ADP-heptose as a new PAMP.

Abstract Metabolic pathways are now considered as intrinsic virulence attributes of pathogenic bacteria and hence represent potential targets for anti-bacterial strategies. Here, we addressed the role of the pentose phosphate pathway (PPP) and its connections with other metabolic pathways in the pathophysiology of Francisella novicida . The involvement of the PPP in Francisella intracellular life cycle was first demonstrated with the study of PPP inactivation mutants. Indeed, inactivation of tktA, rpiA or rpe genes, severely impaired intramacrophagic multiplication during the first 24 hours. Time-lapse video microscopy demonstrated that rpiA and rpe mutants were able to resume late intracellular bacterial multiplication. To get further insight into the links between the PPP and other metabolic networks of the bacterium, we next performed a thorough proteo-metabolomic analysis of these mutants. We show that the PPP constitutes a major bacterial metabolic hub with multiple connections with glycolysis, tricarboxylic acid cycle and other pathways, such as fatty acid degradation and sulfur metabolism. Hence, our study highlights how the PPP is instrumental to Francisella pathogenesis and growth in its intracellular niche.

Francisella tularensis is a facultative intracellular pathogen that causes the zoonoticdisease tularemia in human and animal hosts. This bacterium possesses a non-canonical type VI secretion systems (T6SS) required for phagosomal escape and access to its replicative niche in the cytosol of infected macrophages. KCl stimulation has been previously used to trigger assembly and secretion of the Francisella T6SS in culture. We found that the amounts of essentially all the TSS6 proteins remained unchanged upon KCl stimulation. We therefore hypothesized that a post-translational modification might be involved in T6SS assembly. A whole cell phosphoproteomic analysis allowed us to identify a unique phosphorylation site on IglB, the TssC homologue and key component of the T6SS sheath. Importantly, the phosphorylated form of IglB was not present in the contracted sheath and 3D modeling indicated that the charge repulsion provoked by addition of a phosphogroup on tyrosine 139 was likely to weaken the stability of the sheath structure. Substitutions of the phosphorylatable residue of IglB (tyrosine 139) with alanine or with phosphomimetics prevented T6SS formation and totally impaired phagosomal escape. In contrast, the substitution with the non-phosphorylatable aromatic analog phenylalanine impaired but did not prevent phagosomal escape and cytosolic bacterial multiplication in J774-1 macrophages. Altogether these data suggest that phosphorylation of the sheath participates to T6SS disassembly. Post-translational modifications of the sheath may represent a previously unrecognized mechanism to finely modulate the dynamics of T6SS assembly disassembly.