ABSTRACT Background The increased usage of error-prone long-read sequencing for metabarcoding of fungi has not been matched with adequate public databases and concomitant analysis approaches. We address this gap and present a proof-of-concept study for classifying fungal taxa using linked machine learning classifiers. We demonstrate the capability of linked machine learning classifiers to accurately classify species and strains using real-world and simulated fungal ribosomal DNA datasets, including plant and human pathogens. We benchmark our new approach in comparison to current alignment and k-mer based methods based on synthetic mock communities. We also assess real world applications of species identification in complex unlabelled datasets. Results Our machine learning approach assigned individual nanopore long-read amplicon sequences to fungal species with high recall rates and low false positive rates. Importantly, our approach successfully distinguished between closely-related species and strains when individual read errors were higher than the genetic distance between individual taxa, which the alignment and k-mer methods could not do. The machine learning approach showed an ability to identify key species with high recall rates, even in complex samples of unknown species composition. Conclusions A proof of concept machine learning approach using a tree-descent approach on a decision tree of classifiers can identify known taxa with high accuracy, and precisely detect known target species from complex samples with high recall rates. We propose this approach is suitable for detecting the known knowns of pathogens or invasive species in any environment of mostly unknown composition, including agriculture and wild ecosystems.

Abstract The identity and diversity of Kordyana species on three native species of Commelinaceae in Australia were studied following surveys in 2020–2022 for Kordyana brasiliensis , which had been deliberately released as a biocontrol agent for the environmental weed Tradescantia fluminensis . Three new species of Kordyana are described from Australia based on DNA sequence analysis of the ITS and LSU rDNA regions, morphology, host associations, and geographic distributions. Two new species, Kordyana spectabilis on Aneilema acuminatum and Kordyana luteoalba on Pollia crispata , occur in shaded rainforest habitats in eastern Australia. The third new species, Kordyana occidentalis on Commelina ensifolia , occurs in forests and woodlands of the Kimberley region of Western Australia. Morphological descriptions are provided for these three new species of Kordyana as well as for the conidial stage of K. brasiliensis .

Abstract Background and Aims Plant–fungus symbioses may experience temporal turnover during the ontogenetic or phenological development of the host, which can influence the ecological requirements of the host plant. In this study, we investigate temporal turnover of Ceratobasidiaceae orchid mycorrhizal fungal (OMF) communities in Prasophyllum (Orchidaceae), asking whether OMF communities are subject to temporal change attributable to orchid phenology or ontogeny. Methods Roots of adult Prasophyllum frenchii, Prasophyllum lindleyanum and Prasophyllum sp. aff. validum from Australia were sampled between autumn and spring. Seed was sown in situ as ‘baits’ to explore the mycorrhizal associations of germinating protocorms, which were compared with OMF in roots of co-occurring adult plants. Culture-dependent and -independent sequencing methods were used to amplify the internal transcribed spacer and mitochondrial large subunit loci, with sequences assigned to operational taxonomic units (OTUs) in phylogenetic analyses. Germination trials were used to determine whether fungal OTUs were mycorrhizal. Key Results A persistent core of OMF was associated with Prasophyllum, with Ceratobasidiaceae OMF dominant in all three species. Phenological turnover occurred in P. lindleyanum and P. sp. aff. validum, but not in P. frenchii, which displayed specificity to a single OTU. Ontogenetic turnover occurred in all species. However, phenological and ontogenetic turnover was typically driven by the presence or absence of infrequently detected OTUs in populations that otherwise displayed specificity to one or two dominant OTUs. Ex situ germination trials showed that 13 of 14 tested OTUs supported seed germination in their host orchid, including eight OTUs that were not found in protocorms in situ. Conclusions An understanding of OMF turnover can have practical importance for the conservation of threatened orchids and their mycorrhizal partners. However, frameworks for classifying OMF turnover should focus on OTUs important to the life cycle of the host plant, which we suggest are likely to be those that are frequently detected or functionally significant.

Orchid mycorrhizal fungi (OMF) associations in the Orchidaceae are thought to have been a major driver of diversification in the family. In the terrestrial orchid tribe Diurideae, it has long been hypothesised that OMF symbiont associations may reflect evolutionary relationships among orchid hosts. Given that recent phylogenomic efforts have been unable to fully resolve relationships among subtribes in the Diurideae, we sought to ascertain whether orchid OMF preferences may lend support to certain phylogenetic hypotheses. First, we used phylogenomic methods and Bayesian divergence time estimation to produce a genus-level tree for the Diurideae. Next, we synthesised decades of published fungal sequences and morphological/germination data to identify dominant fungal partners at the genus scale and perform ancestral state reconstruction to estimate the evolutionary trajectory of fungal symbiont shifts. Across the tribe, we found phylogenomic discordance stemming from incomplete lineage sorting. However, our results also revealed unprecedented phylogenetic niche conservatism of fungal symbionts within the tribe: entire genera, subtribes, and even groups of related subtribes associate with only a single fungal family, suggesting that fungal symbiont preferences in the Diurideae do indeed reflect phylogenetic relationships among orchid hosts. Moreover, we show that these relationships have evolved directionally from generalist associations with multiple fungal families towards more specific partnerships with only one fungal family. Orchid symbiont preferences here provide new insights into the placement of several groups with longstanding phylogenetic uncertainty. In spite of complex evolutionary histories, host-symbiont relationships can be used to help detangle alternative phylogenetic hypotheses.