Abstract Ghrelin, also called “the hunger hormone”, is a gastric peptide hormone that regulates food intake, body weight, as well as taste sensation, reward cognition, learning and memory. One unique feature of ghrelin is its acylation, primarily with an octanoic acid, which is essential for its binding and activation of the ghrelin receptor, a G protein-coupled receptor. The multifaceted roles of ghrelin make ghrelin receptor a highly attractive drug target for growth retardation, obesity, and metabolic disorders. Here we present two cryo-electron microscopy structures of G q -coupled ghrelin receptor bound to ghrelin and a synthetic agonist, GHRP-6. Analysis of these two structures reveals a unique binding pocket for the octanoyl group, which guides the correct positioning of the peptide to initiate the receptor activation. Together with mutational and functional data, our structures define the rules for recognition of the acylated peptide hormone and activation of ghrelin receptor, and provide structural templates to facilitate drug design targeting ghrelin receptor.

Abstract G protein-coupled bile acid receptor (GPBAR) is a membrane receptor that senses bile acids to regulate diverse functions through Gs activation. Here, we report the cryo-EM structures of GPBAR–Gs complexes stabilized by either high-affinity P395 or the semisynthesized bile acid derivative INT-777 at 3-Å resolution. These structures revealed a large oval-shaped ligand pocket with several sporadic polar groups to accommodate the amphipathic cholic core of bile acids. A fingerprint of key residues recognizing diverse bile acids in the orthosteric site, a putative second bile acid binding site with allosteric properties and structural features contributing to bias property were identified through structural analysis and mutagenesis studies. Moreover, structural comparison of GPBAR with other GPCRs uncovered an atypical mode of receptor activation and G-protein– coupling, featuring a different set of key residues connecting the ligand binding pocket to the Gs coupling site, and a specific interaction motif localized in intracellular loop 3. Overall, our study not only provides unique structural features of GPBAR in bile acid recognition, allosteric effects and biased signaling, but also suggests that distinct allosteric connecting mechanisms between the ligand binding pocket and the G protein binding site exist in the GPCR superfamily.

The CRISPR-Cas9 system has emerged as the most prevalent gene editing technology due to its simplicity, high efficiency, and low cost. However, the homology-directed repair (HDR)-mediated gene knock-in in this system suffers from low efficiency, which limits its application in animal model preparation, gene therapy, and agricultural genetic improvement. Here, we report the design and optimization of a simple and efficient reporter-based assay to visualize and quantify HDR efficiency. Through random screening of a small molecule compound library, two groups of compounds, including the topoisomerase inhibitors and PIM1 kinase inhibitors, have been identified to promote HDR. Two representative compounds, etoposide and quercetagetin, also significantly enhance the efficiency of CRISPR-Cas9 and HDR-mediated gene knock-in in mouse embryos. Our study not only provides an assay to screen compounds that may facilitate HDR but also identifies useful tool compounds to facilitate the construction of genetically modified animal models with the CRISPR-Cas9 system.

Peptide hormones and neuropeptides are complex signaling molecules that predominately function through G protein-coupled receptors (GPCRs). Two fundamental questions remained in the field of peptide-GPCR signaling systems are the basis for the diverse binding mode of peptide ligands and the specificity of G protein coupling. Here we report the structures of a neuropeptide, galanin, bound to its receptors, GAL1R and GAL2R, in complex with their primary G protein subtypes G i and G q , respectively. The structures reveal a unique binding pose of galanin, which almost ‘lay flat’ on the top of the receptor transmembrane domain pocket in an α-helical conformation, and acts as an ‘allosteric-like’ agonist via a distinct signal transduction cascade. The structures also uncover the important features of intracellular loop 2 (ICL2) that mediate specific interactions with G q , thus determining the selective coupling of G q to GAL2R. ICL2 replacement in G i -coupled GAL1R, μOR, 5-HT 1A R, and G s -coupled b2AR and D1R with that of GAL2R promotes G q coupling of these receptors, highlighting the dominant roles of ICL2 in G q selectivity. Together our results provide important insights into peptide ligand recognition and allosteric activation of galanin receptors and uncover a general structural element for G q coupling selectivity.

Abstract The neuropeptide 26RFa, a member of the RF-amide peptide family, activates the pyroglutamylated RF-amide peptide receptor (QRFPR), a class A GPCR. The 26RFa/QRFPR system plays critical roles in energy homeostasis, making QRFPR an attractive drug target for treating obesity, diabetes, and eating disorders. However, the lack of structural information has hindered our understanding of the peptide recognition and regulatory mechanism of QRFPR, impeding drug design efforts. In this study, we determined the cryo-EM structure of the G q -coupled QRFPR bound to 26RFa. The structure reveals a unique assembly mode of the extracellular region of the receptor and the N-terminus of the peptide, and elucidates the recognition mechanism of the C-terminal heptapeptide of 26RFa by the transmembrane binding pocket of QRFPR. The study also clarifies the similarities and distinctions in the binding pattern of the RF-amide moiety in five RF-amide peptides and the RY-amide segment in neuropeptide Y. These findings deepen our understanding of the RF-amide peptide recognition, aiding in the rational design of drugs targeting QRFPR and other RF-amide peptide receptors.