Abstract Three-dimensional (3D) tracking of surface-tethered single-particle reveals the dynamics of the molecular tether. However, most 3D tracking techniques lack precision, especially in axial direction, for measuring the dynamics of biomolecules with spatial scale of several nanometers. Here we present a plasmonic imaging technique that can track the motion of ∼100 tethered particles in 3D simultaneously with sub-nanometer axial precision at millisecond time resolution. By tracking the 3D coordinates of tethered particle with high spatial resolution, we are able to determine the dynamics of single short DNA and study its interaction with enzyme. We further show that the particle motion pattern can be used to identify specific and non-specific interactions in immunoassays. We anticipate that our 3D tracking technique can contribute to the understanding of molecular dynamics and interactions at the single-molecule level.

The PrrAB two-component system (TCS) is essential for Mycobacterium tuberculosis viability. Previously, it was demonstrated that PrrA binds DNA in the absence of PrrB-mediated transphosphorylation and that non-cognate serine/threonine-kinases phosphorylate PrrA threonine-6 (T6). Therefore, we investigated the differential binding affinity and regulatory properties of the M. tuberculosis-derived wild-type PrrA, PrrA phosphomimetic (D58E, T6E), and PrrA phosphoablative (D58A, T6A) proteins with the prrA

Abstract Plasmonic scattering microscopy has advanced the evanescent detection approaches by offering wide-field single-molecule imaging capability. However, two limitations prevent the broader application of plasmonic single-molecule imaging. One is the heating effect accompanying the plasmonic enhancement, and the other is the complicated system structure resulting from the two-objective optical arrangement. Here, we report single-objective evanescent scattering microscopy. The evanescent field is created by total internal reflection instead of the surface plasmon resonance on the gold film. As a result, the sensing substrate without gold film produces little heat, and allows excitation and observation using one objective. In addition, this system enables quantification of protein binding kinetics by simultaneously counting the binding of individual molecules and recording their binding sites with nanometer precision, providing a digital method to measure binding kinetics with high spatiotemporal resolution. This work may pave a road for label-free single protein analysis in conventional microscopy. Teaser Label-free single-molecule imaging on a total internal reflection fluorescence objective.

Abstract Multiplexed protein detection is critical for improving the drug and biomarkers screening efficiency. Here we show that multiplexed protein detection and parallel protein interaction analysis can be realized by evanescent scattering microscopy with label-free digital single-molecule counting. We implemented an automatic single-molecule counting strategy with high temporal resolution to precisely determine the binding time, which improves the counting efficiency and accuracy. We show that digital single-molecule counting can recognize proteins with different molecular weights, thus making it possible to monitor the protein binding processes in the solution by real time tracking the numbers of free and bound proteins landing on the sensor surface. Furthermore, we show that this strategy can simultaneously analyze the kinetics of two different protein interaction processes on the surface and in the solution. This work may pave a way to investigate complicated protein interactions, such as the competition of biomarker-antibody binding in biofluid with biomarker-protein binding on the cellular membrane.

ABSTRACT Plasmonic absorption of light can create significant local heat and has become a promising tool for rapid temperature regulation in diverse fields, from biomedical technology to optoelectronics. Current plasmonic heating usually relies on specially designed nanomaterials randomly distributed in the space and hardly provides uniform temperature regulation in a wide field. Herein we report a rapid temperature regulation strategy on a plain gold-coated glass slip using the plasmonic scattering microscopy, which can be referred to as wide-field plasmonic thermal microscopy (W-PTM). We calibrated the W-PTM by monitoring the phase transition of the temperature-sensitive polymer solutions, showing that it can provide a temperature regulation range of 33-80 °C. Moreover, the W-PTM provides imaging capability, thus allowing the statistical analysis of the phase-transitioned polymeric nanoparticles. Finally, we demonstrated that W-PTM can be used for noninvasive and local regulation of the transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) ion channels in the living cells, which can be monitored by simultaneous fluorescence imaging of calcium influx. With the nondestructive local temperature-regulating and concurrent fluorescence imaging capability, we anticipate that W-PTM can be a powerful tool to study cellular activities associated with cellular membrane temperature changes.