Abstract The Mediterranean region with its islands is among top biodiversity hotspots. It houses numerous freshwater taxa with a high rate of endemism, but is heavily impacted by anthropogenic pressures and global climate change. To conserve biodiversity, reliable data on species and genetic diversity are needed especially for the scarcely known insular freshwater ecosystems. Environmental DNA metabarcoding provide a straight-forward opportunity to assess aquatic biodiversity. Therefore, we conducted the first eDNA metabarcoding study in one stream catchment on Sicily. Specifically, we aimed to i) investigate spatial diversity patterns of macroinvertebrate communities, ii) assess seasonal changes, and iii) check if dispersal barriers can be identified. Water samples were taken at 27 different sites in two seasons and eDNA metabarcoding performed using the COI gene. In total, we detected 98 macroinvertebrate species, including 28 taxa potentially new to Sicily. Exact sequence variant (ESV) and species composition data showed that diversity differed between seasons with less taxa detected in winter. We also detected a dispersal barrier, which had a stronger effect in autumn. Our findings show that eDNA metabarcoding provides valuable information on Sicilian freshwater biodiversity. We therefore encourage its application for understudied regions to better understand the state and dynamics of freshwater biodiversity.

Genetic diversity is the most basal level of biodiversity and determines the evolutionary capacity of species to adapt to changing environments, yet it is typically neglected in routine biomonitoring and stressor impact assessment. For a comprehensive analysis of stressor impacts on genetic diversity, it is necessary to assess genetic variants simultaneously in many individuals and species. Such an assessment is not as straight-forward and usually limited to one or few individual species. However, nowadays species diversity can be assessed by analysing thousands of individuals of a community simultaneously with DNA metabarcoding. Recent bioinformatic advances also allow for the extraction of exact sequence variants (ESVs or haplotypes) in addition to Operational Taxonomic Units (OTUs). By using this new capability, we here evaluated if the analysis of mitochondrial genetic diversity in addition to species diversity can provide insights into responses of stream macrozoobenthic communities to environmental stressors. For this purpose, we analysed macroinvertebrate bulk samples of three German river systems with different stressor levels using DNA metabarcoding. While OTU and haplotype number were negatively correlated with stressor impact, this association was not as clear when looking at haplotype diversity. Here, stressor responses were only found for sensitive EPT (Ephemeroptera, Plecoptera, Trichoptera) taxa, and those exceedingly resistant to organic stress. An increase in haplotype number per OTU and haplotype diversity of sensitive taxa was observed with an increase in ecosystem quality and stability, while the opposite pattern was detected for pollution resistant taxa. However, this pattern was less prominent than expected based on the strong differences in stressor intensity between sites. To compare genetic diversity among river systems, only OTUs could be used, which were present in all systems. As OTU composition differed strongly between the rivers, this led to the exclusion of a high number of OTUs, especially in diverse river systems of good quality, which potentially diminished the genetic diversity patterns. To better understand responses of genetic diversity to environmental stressors for example in river ecosystems, it would be important to increase OTU overlap between sites of comparisons, e.g. by sampling a narrower stressor gradient, and to perform calibrated studies controlling for the number and individual genotypes. However, this pioneer study shows that the extraction of haplotypes from DNA metabarcoding datasets is a promising tool to simultaneously assess mitochondrial genetic diversity changes in response to environmental impacts for a metacommunity.

Biodiversity is under threat by the ongoing global change and especially freshwater ecosystems are under threat by intensified land use, water abstraction and other anthropogenic stressors. In order to monitor the impacts that stressors have on freshwater biodiversity, it is important to know the current state of ecosystems and species living in them. This is often hampered by lacking knowledge on species and genetic diversity due to the fact that many taxa are complexes of several morphologically cryptic species. Lacking knowledge on species identity and ecology can lead to wrong biodiversity and stream quality assessments and molecular tools can greatly help resolving this problem. Here, we studied larvae of the caddisfly family Sericostomatidae in the Montseny mountains on the Iberian Peninsula. We expected to find cryptic species and that species would not occur in syntopy due to different ecological niches. We sampled 44 stream sites and sequenced 247 larval specimens for the barcoding region of the mitochondrial cytochrome c oxidase gene. A modeling approach was used to assess the bioclimatic preferences of the found species. Two molecular groups were identified. One could be assigned to Schizopelex furcifera and one to Sericostoma spp. We did find both taxa in syntopy in >50% of sampling sites and could show that the taxa prefer similar bioclimatic conditions. A reexamination of larval specimens showed that Sericostoma and Schizopelex larvae could not be unambiguously identified to the genus level. Overall, our results show the importance of including molecular tools into biodiversity assessments in order to correctly identify the species diversity of a region and to prevent wrong assessment results.

Anthropogenic impacts like intensified land use and climate change are severe threats to freshwater biodiversity and effective biodiversity monitoring is therefore one of the most urgent tasks. This is however often hampered by the lack of knowledge regarding the number and ecology of species. Molecular tools have shown many freshwater taxa to comprise morphologically cryptic species, which often occur in sympatry on a small geographic scale. Here, we studied the freshwater snail Ancylus fluviatilis (MUELLER, 1774) species complex in the Iberian Montseny Mountains. We hypothesised 1) that several species of A. fluviatilis sensu lato occur in the Montseny, 2) that different Ancylus species seldom co-occur in syntopy due to different ecological demands or interspecific competition, and 3) that species show a pattern of strong population structure within streams or catchments due to ecological preferences or local adaptation. We barcoded 180 specimens from 36 sites in the Montseny for the cytochrome c oxidase subunit I (COI) barcoding gene and molecularly identified two Ancylus species. These species seldom occurred in syntopy and a species distribution modelling approach showed differing bioclimatic preferences of the species. One species mainly occurs in cooler, higher altitude streams while the second species occurs in lower-altitude areas with higher temperatures. Tests of population structure showed that both species possibly do not disperse well in the study area and that populations within species are likely adapted to certain bioclimatic conditions in different regions of the Montseny. Our results highlight the need to incorporate molecular techniques into routine monitoring programmes.

Abstract Water flow in river networks is frequently regulated by man-made in-stream barriers. These obstacles can hinder dispersal of aquatic organisms and isolate populations leading to the loss of genetic diversity. Although millions of small in-stream barriers exist worldwide, such as weirs below 2 m or tunnels and pipes, their impact on the dispersal of macroinvertebrates with strictly aquatic life cycles is unclear. We therefore assessed the effects of such barriers on the population structure and effective dispersal of five macroinvertebrate species with strictly aquatic life cycles: the amphipod crustacean Gammarus fossarum (clade 11), three snail species of the Ancylus fluviatilis species complex and the flatworm Dugesia gonocephala . We studied populations at nine weirs and eight culverts (3 pipes, 5 tunnels), built 33-109 years ago, in the heavily fragmented catchment of the river Ruhr (Sauerland, Germany). To assess fragmentation and barrier effects, we generated genome-wide SNP data using ddRAD sequencing and evaluated clustering, differentiation between populations up- and downstream of each barrier and effective migration rates among sites and across barriers. Additionally, we applied population genomic simulations to assess expected differentiation patterns under different gene flow scenarios. Our data show that populations of all species are highly isolated at regional and local scales within few kilometres. While the regional population structure likely results from historical processes, the strong local differentiation suggests that contemporary dispersal barriers exist. However, we identified significant barrier effects only for pipes (for A. fluviatilis II and III) and few larger weirs (>1.3 m; for D. gonocephala ). Therefore our data suggest that most small in-stream barriers can probably be overcome by all studied taxa frequently enough to prevent fragmentation. Thus, the barriers leading to population isolation after few kilometres still need to be identified. Specifically, it remains to be tested if the strong local differentiation is a result of a cumulative effect of small barriers, or if e.g. larger in-stream barriers, land use, chemical pollution, urbanisation, or a combination of these factors impede gene flow.