Abstract Cells rapidly remodel their proteomes to align their cellular metabolism to environmental conditions. Ubiquitin E3 ligases enable this response, by facilitating rapid and reversible changes to protein stability, localization, or interaction partners. In S. cerevisiae , the GID E3 ligase regulates the switch from gluconeogenic to glycolytic conditions through induction and incorporation of the substrate receptor subunit Gid4, which promotes the degradation of gluconeogenic enzymes. Here, we show an alternative substrate receptor, Gid10, which is induced in response to changes in temperature, osmolarity and nutrient availability, and regulates the ART-Rsp5 pathway. Art2 levels are elevated upon GID10 deletion, a crystal structure shows the basis for Gid10-Art2 interactions, and Gid10 directs a GID E3 ligase complex to ubiquitinate Art2. We also find that the GID E3 ligase affects the flux of plasma membrane nutrient transporters during heat stress. The data reveal GID as a system of E3 ligases with metabolic regulatory functions outside of glycolysis and gluconeogenesis, controlled by distinct stress-specific substrate receptors.

SUMMARY To achieve precise cellular regulation, E3 ubiquitin ligases must be configured to match substrate quaternary structures. Here, by studying the yeast GID complex, mutation of which is G lucose- I nduced D egradation deficient, we discover supramolecular chelate assembly as an E3 ligase strategy for targeting an oligomeric substrate. Cryo EM structures show that to bind the tetrameric substrate fructose-1,6-bisphosphatase (Fbp1), two otherwise functional GID E3s assemble into a 20-protein Chelator-GID SR4 , which resembles an organometallic supramolecular chelate. The Chelator-GID SR4 assembly avidly binds multiple Fbp1 degrons and positions Fbp1 so that its protomers are simultaneously ubiquitylated at lysines near its allosteric and substrate binding sites. Significantly, key structural and biochemical features -including capacity for supramolecular assembly - are preserved in the human ortholog, the CTLH E3. Based on our integrative structural, biochemical and cell biological data, we propose that higher-order E3 ligase assembly generally underlies multipronged targeting, capable of simultaneously incapacitating multiple protomers and functionalities of oligomeric substrates.

Abstract N-degron E3 ubiquitin ligases recognize specific residues at the N-termini of substrates. Although molecular details of N-degron recognition are known for several E3 ligases, the range of N-terminal motifs that can bind a given E3 substrate binding domain remains unclear. Here, studying the Gid4 and Gid10 substrate receptor subunits of yeast “GID”/human “CTLH” multiprotein E3 ligases, whose known substrates bear N-terminal prolines, we discovered capacity for high-affinity binding to diverse N-terminal sequences determined in part by context. Screening of phage displaying peptide libraries with exposed N-termini identified novel consensus motifs with non-Pro N-terminal residues distinctly binding Gid4 or Gid10 with high affinity. Structural data reveal that flexible loops in Gid4 and Gid10 conform to complementary folds of diverse interacting peptide sequences. Together with analysis of endogenous substrate degrons, the data show that degron identity, substrate domains harboring targeted lysines, and varying E3 ligase higher-order assemblies combinatorially determine efficiency of ubiquitylation and degradation.

Abstract The development of haematopoietic stem cells into mature erythrocytes – erythropoiesis – is a controlled process characterized by cellular reorganisation and drastic reshaping of the proteome landscape. Failure of ordered erythropoiesis is associated with anaemias and haematological malignancies. Although the ubiquitin (UB) system is a known crucial post-translational regulator in erythropoiesis, how the erythrocyte is reshaped by the UB system is poorly understood. By measuring the proteomic landscape of in vitro human erythropoiesis models, we found dynamic differential expression of subunits of the CTLH E3 ubiquitin ligase complex that formed distinct maturation stage-dependent assemblies of structurally homologous RANBP9-and RANBP10-CTLH complexes. Moreover, protein abundance of CTLH’s cognate E2-conjugating enzyme UBE2H increased during terminal differentiation, which depended on catalytically active CTLH E3 complexes. CRISPR-Cas9 mediated inactivation of all CTLH E3 assemblies by targeting the catalytic subunit MAEA, or UBE2H , triggered spontaneous and accelerated maturation of erythroid progenitor cells including increased heme and haemoglobin synthesis. Thus, the orderly progression of human erythropoiesis is controlled by the assembly of distinct UBE2H-CTLH modules functioning at different developmental stages.

Cells respond to environmental changes by toggling metabolic pathways, preparing for homeostasis, and anticipating future stresses. For example, in Saccharomyces cerevisiae, carbon stress-induced gluconeogenesis is terminated upon glucose availability, a process that involves the multiprotein E3 ligase, GIDSR4, recruiting N-termini and catalyzing ubiquitylation of gluconeogenic enzymes. Here, genetics, biochemistry, and cryo electron microscopy define molecular underpinnings of glucose-induced degradation. Unexpectedly, carbon stress induces an inactive anticipatory complex (GIDAnt), which awaits a glucose-induced substrate receptor to form the active GIDSR4. Meanwhile, other environmental perturbations elicit production of an alternative substrate receptor assembling into a related E3 ligase complex. The intricate structure of GIDAnt enables anticipating and ultimately binding various N-degron targeting (i.e. "N-end rule") substrate receptors, while the GIDSR4 E3 forms a clamp-like structure juxtaposing substrate lysines with the ubiquitylation active site. The data reveal evolutionarily conserved GID complexes as a family of multisubunit E3 ubiquitin ligases responsive to extracellular stimuli.

HIV-1 protease (PR) cleavage of the Gag polyprotein triggers the assembly of mature, infectious particles. Final cleavage of Gag occurs at the junction helix between the capsid protein CA and the SP1 spacer peptide. Here we used MicroED to delineate the binding interactions of the maturation inhibitor bevirimat (BVM) using very thin frozen-hydrated, three-dimensional microcrystals of a CTD-SP1 Gag construct with and without bound BVM. The 2.9-A MicroED structure revealed that a single BVM molecule stabilizes the 6-helix bundle via both electrostatic interactions with the dimethysuccinyl moiety and hydrophobic interactions with the pentacyclic triterpenoid ring. These results provide insight into the mechanism of action of BVM and related maturation inhibitors that will inform further drug discovery efforts. This study also demonstrates the capabilities of MicroED for structure-based drug design.